酶反应动力学-教学用

1、酶促反应动力学,第 10 章,酶促反应动力学： 研究酶促反应的速度及其影响因素的科学。为酶的机理研究提供实验证据，指导酶在生产中的应用。,(一) 酶促反应动力学的基本公式-米-曼氏方程(二) 米-曼氏方程所确定的图形是一直角双曲线(三) 米-曼氏动力学参数的意义(四) 米-曼氏方程的线性化作图求Km和Vmx值,二、底物浓度对酶促反应速率的影响,酶浓度、pH、温度等条件不变情况下, 研究底物浓度和反应速度的关系。 低底物浓度时, 反应速度与底物浓度成正比，一级反应。底物浓度达到一定值后，几乎所有的酶都与底物结合，反应速度达到最大值(Vmax)，此时再增加底物浓度，反应速度不再增加，零级反应。,教

2、学内容,1913，德化学家Michaelis L和Menten M 根据中间产物学快速平衡模型或平衡稳态模型，称为米-曼氏模型。,中间复合体学说：,Ks：解离平衡常数； Kcat：催化常数,(一) 酶促反应动力学的基本公式：米-曼氏方程,基于快速平衡模型或平衡稳态模型的米氏方程: 早年的米式方程 最初，Michaelis 和 Menten 根据“快速平衡假说”推出米式方程。 快速平衡假说：一些假设,米式方程的导出：,初始阶段，初始底物浓度S0E0 初始酶浓度，初始底物浓度之用去很小部分底物浓度S可看成是S0 。,限速步骤，K2 K-1 P的生成不足以破坏快速平衡,酶守恒公式：E+ES=Et =

3、E0,没被考虑： 要忽略之，P接近0。此米-曼氏方程只适用于初速率,k-1,游离的酶与底物形成ES的速度极快，而ES形成产物的速度极慢，ES分解成产物P对于ES浓度的动态平衡没有影响。 ES的生成速度：K1(Et - ES)S ES的分解速度：K-1ES K1(Et - ES)S = K-1ES,V max = Kcat Et,此模型不具有普遍性,steady-state theory：反应进行不长的一段时间内(几毫秒，前稳态)，系统的ES浓度由0增加到一定数值，在一定时间内，尽管底物浓度不断变化，ES也在不断合成和分解，但是当反应系统中ES的生成和分解速率相等时，络合物ES的浓度保持不变，这

4、种状态称为稳态,1952，Briggs G E和Haldane J B S 的“稳态理论”及其对米式方程的发展：稳态模型或Briggs-Haldane氏模型,K-1 K-2,酶促反应过程中前稳态和稳态期间各种浓度变化（A）和速率变化（B）,ES生成速度：K1(Et - ES)S ES分解速度：k2ES+k-1ES 稳态时：k1(Et - ES)S = k2ES+k-1ES,Vmax=kcat Et,K-1 K-2,Km 比Ks 更具普遍性。稳态下，当K2K-1时，则Km= K-1/K1 =Ks ， 因此平衡态可以看成是稳态的一个特例,(二) 米-曼氏方程所确定的图形是一直角双曲线,以初始速率作

5、为初始底物浓度S的函数所做的底物饱和曲线，也称米-曼氏作图或米-曼氏曲线,将实验测定的米-曼氏曲线的坐标作平移，并用新坐标系 (x，y) 表示旧坐标系(v0，S)，米-曼氏方程可以转变为 xy = -Km 其曲线为以坐标轴(x，y)为渐近线的直角或等轴或等边双曲线,从米-曼氏方程或其曲线可以看出三种情况：,(三) 米一曼氏动力学参数的意义,KM 的意义: 真实解离常数和表观解离常数 Kcat 的意义: 催化常数或转换数 Kact/KM 的意义: 催化效率指数或专一性常数,米氏常数KM是 v0=1/2 Vmax时的底物浓度。遵循米-曼氏动力学的酶,也称为米-曼型酶, 是指呈现v0对S的双曲线关系

6、的酶。 KM的真实意义决定于酶促反应机制的特定方面, 如反应步骤数目和各步的速率常数。对于简单的二步反应： KM=(K-1+K2)/K1,1. KM的意义: 真实解离常数和表观解离常数,当K2是限速步骤的速率常数时，即k2k-1 ，KM即Ks。此时， KM 的意义是真实解离常数，代表ES复合体中酶对底物的亲和力大小， 但是这种意义对大多数酶是不适用的。 当 k2、k-1 相当时，KM是三个速率常数的函数。,第一步是快速平衡,第二和第三步是慢速过程。应用稳态假设, 从上面模型可以导出胰凝乳蛋白酶催化水解的稳态速率,可见胰凝乳蛋白酶是遵守米-曼氏动力学的。,以胰凝乳蛋白酶催化酯和酰胺类水解为例：,

7、这里,为了某些用途,KM可以作为表观解离常数来处理。例如溶液中游离酶的浓度E可以从下列关系式算得:,ES 所有形式的结合酶浓度的总和, 如上式为ES+EP 按式上式模型可以证明：,因此KM可看成是所有结合酶的整体解离常数，这就是KM作为表观解离常数的意义。,以胰凝乳蛋白酶催化酯和酰胺类水解为例：,特征常数： 一般只与酶的性质有关，与酶的浓度无关。KM值只是在固定的底物，一定的温度和pH条件下，一定的缓冲体系中测定的，不同条件下具有不同的KM值。 判断酶的专一性和天然底物：KM最小的底物为最适或天然底物。 判断酶与底物结合的难易：KM 是 ES分解速度(K-1+K2)与形成速度(K1)的比值，包

8、含ES解离趋势(K-1K1)和产物形成趋势(K2K1)。Ks称为底物常数，Ks=K-1K1，是ES的解离常数，反映ES解离趋势，1/Ks：酶与底物亲和力大小(ES形成趋势)，底物亲和力大不一定反应速度大(产物形成趋势，K2K1 )，只有当K-1、K1 K2时，KM Ks，1/Km 近似地表示底物亲和力的大小。 生产上的实际应用： 已知V求S; 已知S求V 判断某一代谢反应的方向和途径,Km的应用,2. Kcat 的意义：催化常数或转换数,需要提出一个更通用的速率常数，催化常数，Kcat，用来描述任一酶促反应在饱和时的限制速率,如果一个多步骤的反应,其中一步明显是限速的,则该步骤的速率常数就是K

9、cat，K2和K3。 如果几个步骤都是部分限速的,Kcat 可以是几个速率常数的一个复杂函数,例如,Kcat 是k2、k3的函数,胰凝乳蛋白酶催化某些底物时k2k3，kcat= k3。 Kcat 一级反应速率常数，因此量纲是时间-1如min-1，s-1。 kcat有时也称为酶的转换数(turnover number, TN)，它是酶的最大催化活力的量度，即在酶被底物饱和时每一酶分子或每一活性部位(对多亚基酶而言)在单位时间内被转变为产物的底物分子数。转换数也称为酶的分子活力(molecular activity)或催化中心活力。只要反应混合液中酶的总浓度Et为已知， kcat 即可从V max

10、 算出。,当E和S均为变量时，Kcat 是 E+SE+P 反应的表观二级速率常数(单位mol-1s-1L)； Kcat/KM 可作为在远低于饱和量的底物浓度下酶的催化效率指数。此参数常用来比较不同酶的催化效率，特别是比较同一个酶对不同底物(竞争性底物)的催化效率，因此也称为专一性常数。 当酶与底物的相互碰撞是限速步骤时，Kcat/KM可代表真实的微观速率常数。当K2K-1时，KM=k2/k1, 而kcat=k2，,3. Kact/km的意义:催化效率指数或专一性常数,则：,根据：,在生理条件下，大多数酶并不被底物所饱和。 当SKm时，大多数酶处于游离形式E Et:,因此:,k1存在一个上限，取

11、决于酶与底物在水溶液中的碰撞频率。如果每次碰撞都能形成ES复合体，则根据扩散理论预言，k1将约为108 109mol-1s-1L，这是扩散控制的极限范围。酶的催化效率不能超过此极限范围。,直接按米-曼氏方程作图，通过渐近线求出Vmax，再从Vmax/2 求出相应的S，即KM。不准确，只能得到Vmax和KM的近似值，即使S足够大，v0也很难达到渐近线水平(Vmax)。,(四) 米一曼氏方程的线性化作图求KM和Vmax值,米-曼氐方程线性化: 最常见的变换形式是Lineweaver-Butk方程,双倒数(或Lineweaver-Burk)作图,Eadie-Hofstee作图,三、多底物的酶促反应,

12、酶促反应多是两个以上的底物参加的反应，其中双底物的反应最为重要，占50%；连接酶，三底物，占6%。,只有当A、B都达到使酶饱和时，测得的Vmax才是双底物反应的真正最大速率,双底物酶促反应有三种机理：,2.乒乓反应或双置换反应,随机顺序反应机理； 有序顺序反应机理(依次反应)；,1.序列或单置换反应,1. 序列(sequential)或单置换(single-displacement)反应机制,该机制涉及非共价的三元复合体，如AEB和PEQ的形成。,E+A+BAEB PEQ E+P+Q,随机(random)单置换反应这种机制,糖原磷酸化酶,有序顺序反应机理(依次反应),乙醇脱氢酶,谷丙转氨酶,2

13、.乒乓反应或双置换反应,(一) pH对酶促反应的影响(二) 温度对酶促反应的影响(三) 激活剂对酶促反应的影响,四、影响酶促反应速率的其他因素,(一) pH对酶促反应的影响,最适 pH： 使酶促反应速度达到最大时的介质pH； 稳定性 pH： 在一定pH范围内，酶不会变性失活，此范围称酶的稳定性pH。,pH 过酸或过碱引起酶蛋白质的变性，使酶的活力丧失； PH 影响酶分子上侧链基团的解离状态。如果这些基团处在酶的活性中心，则直接影响酶与底物的结合和进一步的催化反应，若处在中心之外,则影响酶的三维结构，从而影响酶的活性； 影响底物的解离状态，或者是底物不能与酶结合,或者结合后不能生成产物。,植物和

14、微生物来源的酶：pH 4.56.5 ； 动物来源的酶：pH 6.58.0之间。例外情况，胃蛋白酶 pH 1.9，胰蛋白酶 pH 8.1，肝精氨酸酶 pH 9.0； 酶的最适pH只在一定条件下才有意义。,酶的最适 pH 一般在4.08.0之间：,温度系数Q10： 温度升高10，反应速度与原来的反应速度（或是速率常数与原速率常数）之比，Q10一般为12。 最适温度范围： 温血动物的酶，35-40； 植物酶40-50； 细菌Taq DNA聚合酶，70。,（二）温度对酶反应速度的影响,温度对酶促反应速度的影响有两个方面：,提高温度，加快反应速度（040）； 提高温度，酶变性失活(60 )。,（三）激活

15、剂对酶反应速度的影响,激活剂（activator)： 凡是能提高酶活性的物质。,阴离子：Cl-、Br-、 I-、PO4- 氢离子,无机离子,还原剂：如，还原型谷胱甘肽等能激活某些活性中心含有-SH的酶。,小分子有机化合物,金属离子：K+ 、Na+、Mg2+ 、Zn2+、Fe2+ 、Ca2+,金属螯合剂：如，EDTA等，去重金属离子，解除抑制作,无机离子的激活作用具有选择性； 不同离子之间有拮抗作用，如Na+与K+、Mg2+与Ca2+，但Mg2+与Zn2+常可替代； 激活剂浓度要适中，150mM，过高往往有抑制作用； 许多金属离子是酶的辅助因子，有些金属离子可稳定酶分子的活性构象，有的金属离子通

16、过生成螯合物，在酶与底物结合中起桥梁作用。,要说明的几个问题：,使一些本来有活性的酶活性进一步提高，主要是离子或简单有机化合物； 激活酶原，无活性有活性，可能是离子或蛋白质。,激活剂作用包括两种情况：,五、酶的抑制作用,(一) 抑制作用的概念 (二) 抑制作用的类型 (三) 可逆抑制的动力学 (四) 酶抑制剂应用举例,抑制剂： 不引起酶蛋白变性，和酶分子上某些必需基团（活性中心上一些基团）结合，引起酶活性下降，甚至丧失。抑制剂有选择性。 抑制作用： 使反应速率减慢或完全停止（不可逆抑制、可逆抑制） 变性剂： 使酶蛋白变性而引起酶活力降低或丧失。无选择性，涉及整个三级结构。 抑制程度表示方法：

17、相对活力( a )；抑制分数( i ),(一)抑制作用的概念,研究抑制剂对酶的作用的意义：,药物作用机理和抑制剂型药物的设计与开发：抗癌药； 阐述某些代谢途径，控制发酵； 研究酶的催化机制，是酶工程和化学修饰酶、酶工业的基础。,不可逆抑制作用 可逆抑制作用,（二）抑制作用的类型,抑制剂与酶的结合是非共价的、可逆的，可以用透析或超过滤等方法除去抑制剂，使酶活性恢复。 抑制剂 I 与游离酶 E 和 ES 之间存在平衡关系，抑制程度由酶对抑制剂的亲和力、抑制剂浓度和底物浓度三者所决定的。 这类抑制可用米-曼氏动力学方程进行分析。,1. 可逆抑制(reversible inhlbition),抑制剂(

18、大多数毒物)和酶的结合是共价的，不能用一般的物理方法解除抑制而使酶“复活”，必须通过特殊的化学处理才可能将抑制剂从酶分子上移去。 这类抑制不能米-曼氏动力学方程进行分析,2. 不可逆抑制(irreversible inhilItlon),1. 可逆抑制(reversible inhlbition)：,竞争性抑制： 反竞争性抑制： 非竞争性抑制：,I 和 S 结构相似，竞争酶的活性部位，如，丙二酸对琥珀酸脱氢酶的抑制。 竞争性抑制可以借助增加底物浓度而解除。,竞争性抑制：,I 只能和ES结合，形成IES三元复合体。I 不影响酶与底物的结合，但它阻止IES生成产物。I 倾向于使ES复合体更加稳定。,反竞争性抑制：,I 与酶活性部位以外的地方结合，既能与游离酶E结合，也能与ES 结合，并且底物和抑制剂与酶的结合严格地互不干扰，有人称之为纯非竞争性抑制。 纯非竞争性抑制较少遇到，多数情况是E与I的结合和E与S的结合互有影响, 被称为混合型非竞争性抑制或混合型抑制。,非竞争性抑制：,(三)可逆抑制作用动力学,1.竞争性抑制,动力学特点：表观Vmax，表观KM,2.非竞