课题3　分解纤维素的微生物的分离 (6)

1、专题2 微生物的培养与应用,课题3 分解纤维素的微生物的分离,1、简述纤维素酶的组成及作用。说出刚果红染色法及其原理（重点） 2、从土壤中分离出分解纤维素的微生物的方法。（重、难点）,纤维素，一种由葡萄糖首尾相连而成的高分子化合物，是地球上含量最丰富的多糖类物质。,植物的根、茎、叶等器官都含有大量的纤维素。但被人类利用的机会少、效率低。,课题背景,植物每年产生的纤维素超过70亿吨，其中40%-60%能被土壤中某些微生物分解利用，这是因为它们能够产生纤维素酶。,对这些微生物的研究与应用，使人类能够利用秸秆等废弃物生产酒精，用纤维素酶处理服装面料等。,如何分离土壤中分解纤维素的微生物呢？,纤维素与

2、纤维素酶,1.纤维素:,多糖(高分子化合物)基本单位:葡萄糖,一、基础知识,土壤中某些微生物能够产生纤维素酶,把纤维素分解为葡萄糖，然后再利用。,纤维素酶是一种复合酶，一般认为它至少包括三种组分，即C1酶(外切酶)、CX酶(内切酶)和葡萄糖苷酶，前两种酶使纤维素分解成纤维二糖，第三种酶将纤维二糖分解成葡萄糖。,2.纤维素酶,（1)组成：,（2)作用：,一种复合酶：C1酶、CX酶和葡萄糖苷酶,取二支20mL的试管。,实验：纤维素酶分解纤维素的实验,各加入一张1cm6cm的滤纸条。,各加入pH4.8，物质的量浓度为0.1mol/L的醋酸醋酸钠缓冲液11ml和10ml。,甲 乙,在乙试管中加入1mL

3、纤维素酶。,两支试管固定在锥形瓶中，放在 140r/min的摇床上振荡1h。,结果：乙试管的滤纸条消失。,讨论：自变量？ 因变量？ 无关变量？乙试管的滤纸条为什么会消失？ 甲试管的作用是什么？,自变量：纤维素酶的有无 自变量的控制： 乙试管-1mL纤维素酶溶液 甲试管-等量的缓冲液 (不能加蒸馏水，会影响溶液的pH)。,刚果红染色法,（二）纤维素分解菌的筛选,2、原理：,1、方法：,即：可根据是否产生透明圈来筛选纤维素分解菌。,刚果红能与纤维素形成红色复合物，而与水解后的纤维二糖和葡萄糖不发生这种反应。,红色复合物,红色消失，出现透明圈,四种纤维素分解菌在刚果红培养基上形成的透明圈,(选择培养

4、基中通过颜色反应直接对微生物进行筛选),思考：纤维素菌在A区域还是在B区域？,降解圈的物质主要是？,透明圈的大小可以表示什么？,三种菌落的纤维素菌，谁分解纤维素的能力强？,二、实验设计,实验流程,思考实验流程中“选择培养” 的目的是什么？,其目的是增加纤维素分解菌的浓度，以确保能够从样品中分离到所需要的微生物。,三、操作提示,土壤取样,30ml选择培养基适宜温度振荡1-2天 直至变混浊,5ml,适量,梯度稀释,涂布,30倒置培养,挑选,纯化培养,研学问题1：本实验的流程与课题2中的实验流程有哪些异同？,课题2:,土壤取样,选择培养基,直接分离,菌落 (分解尿素的细菌),（尿素为唯一氮源）,选择

5、培养,稀释涂布平板法,课题3:,土壤取样,选择 培养基,(纤维素分解菌),（纤维素为主要碳源）,稀释涂布平板法,鉴别 培养基,透明圈,挑选 菌落,（刚果红染色法）,研学问题2：取样中，为什么要在富含纤维素的环境中找纤维素分解菌？,在富含纤维素的环境中纤维素分解菌的含量相对提高,研学问题3：将滤纸埋在土壤中有什么作用？你认为滤纸应该埋进土壤多深？,人工设置纤维素分解菌生存的适宜环境，使纤维素分解菌相对聚集。将纸埋于深约10cm的腐殖土壤中。,【资料一】土壤取样,1、纤维素分解菌选择培养基属于_（固体、液体）培养基，原因是_。,【资料二】选择培养,阅读资料二“选择培养基”，回答以下几个问题：,液体

6、,没有添加琼脂成分,2、该培养基对微生物_（具有，不具有）选择作用。如果具有，其选择机制是 _。,以纤维素粉为唯一碳源，能分解纤维素的微生物可以大量繁殖,具有,液体培养基目的是_。,使纤维素分解菌增殖、含量增多,若设置一个对照实验说明选择培养的作用，应控制的变量是将_改为_。,3、你能否设计一个对照实验，说明选择培养基的作用？,葡萄糖,纤维素粉,方法一：先培养微生物，再加入刚果红进行颜色 反应,方法二：在倒平板时就加入刚果红,【资料三】刚果红染色法（阅读书本）,颜色反应基本上是纤维素分解菌的作用,操作繁琐 刚果红会使菌落之间发生混杂,操作简便 不存在菌落混杂问题,产生淀粉酶的微生物也产生模糊透

7、明圈， 有些微生物能降解色素，形成明显的透明圈。,研学问题4这两种方法各有哪些优点与不足？,研学问题5：为什么选择培养能够“浓缩”所需的微生物？ 在选择培养的条件下，可以使那些能够适应这种营养条件的微生物得到迅速繁殖，而那些不适应这种营养条件的微生物的繁殖被抑制，因此可以起到“浓缩”的作用。,指微生物的种类少了，而某些微生物的数量多了,1.选择哪种实验样品？取样的环境有哪些特点？选择的理由？ 腐殖土，纤维素含量高。因为纤维素菌多。 2.培养基中有杂菌吗？你分离得到的是分解纤维素菌吗？ 由于在土壤中细菌的数量远远高于真菌和放线菌的数量，因此最容易分离得到的是细菌。但由于所取土样的环境不同，不同同

8、学也可能得到真菌和放线菌等不同的分离结果。 如果观察到产生透明圈的菌落，则说明可能获得了分解纤维素的微生物。 3.如何判断实验成功？ 产生透明圈,四、结果分析与评价,为了确定分离得到的是纤维素分解菌，还需要进行_ _实验，纤维素酶的发酵方法有_ 发酵和_ 发酵。纤维素酶测定方法是对纤维素酶分解滤纸等纤维素所产生的_ 含量进行定量测定。,发酵产纤维素酶,液体,固体,葡萄糖,五、课题延伸,双缩脲试剂,婓林试剂/碘液,苏丹(),健那绿,甲基绿、吡罗红,溴麝香粉草蓝,重鉻酸钾溶液,龙胆紫,刚果红,紫色,砖红色沉淀/蓝色,橘黄色/红色,蓝绿色,DNA绿色/RNA红色,由蓝变绿再变黄,橙色变灰绿色,紫色,

9、红色,先加双A再加双B,婓林试剂要现配现用，还要水浴加热,显微镜观察,显微镜观察,甲基绿、吡罗红混合使用,漂洗充分,纤维素,纤维二糖,葡萄糖,C1酶 Cx酶,葡萄糖苷酶,一、纤维素与纤维素酶,1、方法_。该方法可以通过_反应直接筛选。通过是否产生 来筛选纤维素分解菌。,刚果红染色法,颜色,二、纤维素分解菌的筛选,3、培养基：以 为唯一碳源的选择培养基。,纤维素粉,2、原理,透明圈,练一练：,1.下列关于纤维素酶的说法，错误的是,A. 纤维素酶是一种复合酶，至少包括三种 B. 纤维素酶可把纤维素分解成葡萄糖 C. 纤维素酶可用于去掉植物的细胞壁 D. 葡萄糖苷酶可把纤维素分解成葡萄糖,2.利用刚果红染色法可以筛选出纤维素分解菌，下列说法错误的是,A. 刚果红能与纤维素形成红色复合物 B. 刚果红能与纤维二糖形成红色复合物 C