硕士生物仪器分析之荧光.ppt

1、荧光光谱 Fluorescence,几乎所有物质分子都有吸收光谱，但不是所有物质都会发荧光。 产生荧光必须具备以下两个必要条件：, 该物质的分子必须具有能吸收激发光的结构，通常是共轭双键结构。 吸收了与本身特征频率相同的能量之后的物质分子，必须具有高的荧光效率。许多吸光物质并不产生荧光，主要是因为它们将所吸收能量消耗于与溶剂分子或其它分子之间的相互碰撞中，还可能消耗于一次光化学反应中，因而无法发射荧光，即荧光效率很低。,某些物质被一定波长的光照射时，会在一定时间内发射出波长比入射光长的光，如果这个时间比较短，这种光就称为荧光。荧光由一种能发荧光的矿物 萤石(fluospar)而得名。 我们这里

2、要介绍的荧光，是指物质在吸收紫外光和可见光后发出的波长较长的紫外荧光或可见荧光。 除了紫外光和可见光可能激发荧光外，其它的光如红外光、X射线也可能激发出荧光，因此除紫外荧光或可见荧光外，还有红外荧光、X射线荧光等。,用荧光抗体染色之原生动物,澳大利亚科学家最新发现，一种叫“螳螂虾”的海里动物通过发出色彩鲜艳的荧光来恐吓警告敌对者或者吸引性配偶.,K. Brejc et.al., PNAS 94 (1997) 2306,green-fluorescent protein (GFP),2008年诺贝尔化学奖,下村修(Osamu Shimomura)1928年出生于日本京都府，1960年获得名古屋大

3、学理学博士学位后赴美，先后在美国普林斯顿大学、波士顿大学和伍兹霍尔海洋生物实验所工作。他1962年从一种水母中发现了荧光蛋白水母素，被誉为生物发光研究第一人。,马丁沙尔菲(Martin Chalfie)出生于1947年，现年61岁，是美国哥伦比亚大学生物学教授。他获奖的主要贡献在于向人们展示了绿色荧光蛋白（GFP）作为发光的遗传标签的作用，这一技术被广泛运用于生理学和医学等领域。,瑞典皇家科学院2008年10月8日宣布，美籍华裔科学家钱永健、美国生物学家马丁沙尔菲和日本有机化学家兼海洋生物学家下村修共同获得2008年度诺贝尔化学奖，将均分1000万瑞典克朗（约合140万美元）奖金。帮助他们获奖

4、的是绿色荧光蛋白。这种蛋白为生物与医学实验带来革命，它发出的荧光像一盏明灯，帮助研究人员照亮生命体在分子层面和细胞层面的诸多反应。,由于绿色荧光蛋白用紫外线一照就发出鲜艳绿光，研究人员将绿色荧光蛋白基因插入动物、细菌或其他细胞的遗传信息之中，让其随着这些需要跟踪的细胞复制，可“照亮”不断长大的癌症肿瘤、跟踪阿尔茨海默氏症（Alzheimers Disease ）对大脑造成的损害、观察有害细菌的生长，或是探究老鼠胚胎中的胰腺如何产生分泌胰岛素的细胞。,蛋白质的内源荧光,蛋白质的荧光主要是色氨酸残基的荧光。,利用蛋白质中的芳香组氨基酸残基的侧链基团具有吸收紫外区域的入射光从而发射荧光的特性，研究蛋

5、白质在变性或复性过程中整体空间构象的变化。,蛋白质 变性,l max,红移,蛋白质 复性,l max,蓝移,E.Coil,E.Coil,蛋白质的外源荧光,核壳荧光纳米颗粒与活细胞的生物亲和性研究,HNE1细胞与二氧化硅壳荧光纳米颗粒的生物亲和性，连续培养10天，细胞传代四次。（a）没有吞噬纳米颗粒的细胞；（b）吞噬纳米颗粒的细胞。,结构特点：入射光的激发光与荧光探测方向垂直 光源：汞灯、氙灯等 (200800 nm) 测能发射荧光的物质,Fluorescence spectrometer,Fluorescence Quartz cuvette,UV-vis Quartz cuvette,荧光光

6、谱仪,X射线荧光光谱仪,Fluorescence spectrometer,荧光分光光度计 970CRT型 波长范围：激发(EX) 200800 nm； 发射(EM) 200800 nm； 狭缝：激发(EX)2、5、10、20nm 4档； 发射(EM)2、5、10、20、30、 40nm 6档信号噪音比： 蒸馏水的拉曼峰S/N比大于100/高灵敏度高信号噪音比，S/N比达100以上； 双单色器系统结构； 每台 97000.00元。,荧光辐射的波长比激发光波长长，测量到的荧光频率与入射光的频率不同； 荧光在各个方向上都有发射，因此可以在与入射光成直角的方向上检测； 这样，荧光不受来自激发光的本底

7、的干扰，灵敏度大大高于紫外-可见吸收光谱，测量用的样品量很少，且测量方法简便。,1. 灵敏度高,2. 能提供较多的参数，例如激发谱、发射谱、峰位、峰强度、荧光寿命、荧光偏振度等。,3. 还可以检测一些紫外-可见吸收光谱检测不到的时间过程过程。紫外和可见荧光涉及的是电子能级之间的跃迁，荧光产生包括两个过程：吸收以及随之而来的发射。,荧光光谱法的特点,荧光光谱法在蛋白质研究中的应用,1. 利用蛋白质的天然荧光检测蛋白质的构象变化 2. 利用荧光探针检测蛋白质的构象变化 3. 测定蛋白质的含量 4. 测定酶的活性 5. 研究小分子与蛋白质间的相互作用,药物与蛋白质相互作用的荧光光谱法研究概述 槲皮素

8、和芦丁与牛血清白蛋白相互作用研究 荧光法研究咖啡因和茶碱与牛血清白蛋白相互作用 喹诺酮类药物对人血清白蛋白的荧光猝灭研究 荧光检测藻蓝蛋白 荧光分光光度法测定餐具洗涤剂中荧光增白剂,标准曲线法 内标法,Fluorescence microscope,荧光显微镜是以紫外线为光源，用以照射被检物体，使之发出荧光，然后在显微镜下观察物体的形状及其所在位置。 荧光显微镜用于研究细胞内物质的吸收、运输、化学物质的分布及定位等。 细胞中有些物质，如叶绿素等，受紫外线照射后可发荧光；另有一些物质本身虽不能发荧光，但如果用荧光染料或荧光抗体染色后，经紫外线照射亦可发荧光。 荧光显微镜就是对这类物质进行定性和定量研究的工具之一。,荧光显