第十七章螺旋体.ppt

1、第十七章 螺 旋 体,螺旋体是弯曲呈螺旋状、运动活泼的原核细胞型微生物。结构与细菌相似，如有细胞壁、原始核，以二分裂方式繁殖，对抗生素敏感等。 其中致病性螺旋体主要有钩端螺旋体属、疏螺旋体属、密螺旋体属等3个属。,第一节 钩端螺旋体,是人畜共患病，鼠类和猪是储存宿主。在肾中存在，随尿排出，污染水和土壤，人类接触污染疫水。穿透皮肤粘膜侵入，并引起血症，产生如内毒素等物质，引起钩端螺旋体病，出现发热、头痛肌痛、眼结膜充血等中毒症状，患者有全身毛细血管损伤和微循环障碍，并引起肝肾功能损害。由于血清型、毒力数量不同以及免疫水平差异，有流感伤寒型；黄疽出血型；肺出血型；脑膜脑炎型；肾功能衰竭型；胃肠炎型

2、等类型。,应用显微镜凝集试验和凝集素吸收试验，可 进行血清群和型的分类。问号状钩端螺旋体 可分为25个血清群、273 个血清型，其中我 国至少存在19个血清群、74个血清型。我国 目前使用的问号钩端螺旋体参考株有14群15 型。,微生物特性,螺旋细密和规则，一端弯曲使菌体呈问号状 故名钩端螺旋体。G-，但不易着色。常用 Fontana镀银染色法，被染成棕褐色。暗视 野显微镜下可见活泼运动、折光性强而成白 色的钩端螺旋体。 内鞭毛紧紧缠绕在原生质圆柱体表面呈螺旋 状，使钩端螺旋体活泼地沿长轴旋转运动。,培养特性,营养要求较高，常用含10兔血清的Korthof培养基，兔血清除促进钩端螺旋体生长外，

3、尚有中和代谢产物毒性的作用。最适生长温度为2830，最适pH为7276，人工培养基中生长缓慢。在液体培养基中，分裂一次需8lOh，培养一周左右，呈现为半透明云雾状生长，但菌数仅相当于普通细菌的1101100。,抵抗力,对热抵抗力弱，60、1min即死亡。02来苏、l：2000升汞、1石炭酸经1030min被杀灭。 对青霉素敏感。钩端螺旋体在夏秋季酸硷度中性的湿土或水中可存活20天以上，甚至数月之久，这在本菌的传播上有重要意义。,标本采集,钩端螺旋体可从临床标本、携带者和自然界的水中分离获得。 标本采集包括血液、尿和脑脊液，发病早期(1周内)血液的阳性率高，1周后尿和脑脊液等的阳性率高。感染61

4、0天取血可检出抗体，在病程第3或4周达最高水平，此后抗体水平逐渐下降，血清学诊断则需在病程早期及恢复期分别采集血清，作双份血清试验。,标本直接检查,1取急性期病人血以4000rmin离心45 60min，取1滴沉淀物置玻片上，加盖 玻片后作暗视野检查。也可用Fontana 镀银染色法染色后观察。,2核酸检测 采用同位素或生物素、地高辛 标记的特异DNA探针法，检出标本中钩 端螺旋体的核酸，较培养法快速、敏感。 若先用PCB技术先行扩增，再用探针确 定，则敏感度更加提高。,分离培养,取钩端螺旋体血症期的病人血液2ml或发病后第2周的无菌弱碱性尿沉渣接种于Korthof培养基中，28孵育，因系需氧

5、生长，故靠近培养液面呈半透明雾状混浊。 取培养物作暗视野检查，观察有无螺旋体生长。连续观察30d，如无生长方判为阴性,抗体检测,显微镜下凝集试验是常用的方法。 (1)抗原制备：取标准菌株47天的培养物，每 视野5060条活钩端螺旋体。,(2)方法与结果：取病人血清以56，30min灭 活后稀释，每个稀释度01ml 血清中加入 等量活菌抗原，302h后，取1滴覆盖玻片， 暗视野显微镜下若有抗体存在，则钩体凝集 成团，数减少，菌体溶解。 结果判定：50以上菌体凝集或溶解为“2+” 为血清效价。达1：300以上才有诊断意义 或效价增高4倍以上，则可确诊本病。,酶联免疫吸附试验,用ELISA法和IgM

6、斑点-ELISA法等间接检测钩体病人血清中特异性抗体，用于该病的快速诊断。 包被抗原用钩端螺旋体培养物经超声波破碎，15000rmin离心20min，用于包被的抗原浓度以20gml为好。被检血清OD值为阴性对照的2倍，即为阳性。,动物试验,动物是分离钩端螺旋体的敏感方法，尤其适用于有杂菌污染的标本。 方法是将标本接种于幼龄豚鼠或金地鼠腹腔。接种35d后，可用暗视野显微镜检查腹腔液；亦可在接种后36d取心血检查并作分离培养。动物死后解剖，可见皮下、肺部等有大小不等的出血斑，肝、脾脏器中有大量钩端螺旋体存在。,第二节 疏螺旋体属,有310个稀疏而不规则的螺旋，运动活泼。 对人致病的主要有伯氏疏螺旋

7、体、回归热螺旋体、奋森螺旋体等。,一、伯氏疏螺旋体,是莱姆病的主要病原体，1977年在美国莱姆镇发现，从硬蜱及患者体内分离出伯氏疏螺旋休。 1985年我国在黑龙江省林区首次发现莱姆病，1988年从病人血液中分离出病原体，迄今已有十多个省和自治区证实有莱姆病存在。,传播媒介是硬蜱，伯氏疏螺旋体可在蜱的中肠生繁殖，叮咬时使宿主感染。 经330d潜伏期，在叮咬部位可出现慢性移行性红斑。经2-3周，皮损消退，留有斑痕与色素沉着。 早期症状有头痛发热、肌痛等。 80未经治疗的可发展至慢性关节炎、慢性神经系统异常，严重者可同时出现皮肤、神经、关节、心等多脏器损害。,微生物特性,1疏螺旋体，两端稍尖。运动活

8、泼，在培养 基中，不规则地缠绕一起，呈卷圈状。周 浆鞭毛数不等。与运动有关。-易着色。 Giemsa或Wright染色均佳。 2抗原成分 主要的有鞭毛蛋白(40k)、外膜 蛋白A(OspA)、B(OspB)和C(OspC)，60kD 抗原。40kD鞭毛蛋白既是免疫原，也是致 病原之一。,3.营养要求高，培养基需含有长链饱和与不 饱和脂肪酸、葡萄糖、氨基酸和q清蛋白等。 微需氧，510C02促进生长。适宜温度 为35。生长慢， 1代需18h，需培养13 周观察到生长情况。,微生物检验,1标本采集 早期取病损皮肤组织、淋巴结抽 出液、血液。 2. 直接用暗视野显微镜，观察关节滑膜液、脑 脊液、尿液

9、等标本中螺旋体的形态和运动， 因数量太少，故在实验室诊断中价值不大。 用于蜱内脏组织检查,检出率较高。,3.核酸检测,用PCR技术检查DNA，方法快速、敏感性高， 用已知引物，以标本中螺旋体质粒 DNA片段 为模板，扩增后形成309bp的DNA分子(是编 码OspA的基因片段)，经琼脂糖电泳证实。 此DNA分子在所有伯氏疏螺旋体菌株中均可 被检出，而其他菌种则为阴性。,4.分离培养,标本接种在BSK复合培养基中，33孵育。 BSK培养基是含有牛血清白蛋白(BSA)和热灭活兔血清等营养丰富的液体培养基，通常从感染的脾中分离螺旋体较易，而从损伤皮肤中分离较难。 因分裂1代需12h以上，需培养2-3

10、周可观察生长情况。,5.抗体检测,间接免疫荧光法(IFA)：将螺旋体在BSK中培养5-7天，离心8200rpm 30min收集螺旋体，稀释至200个螺旋体高倍镜视野。取20l悬液于玻片上，干燥后用丙酮固定5min。待检血清以PBS倍比稀释，加于玻片1015l稀释血清，湿盒内37孵育 30min，洗后加荧光素标记抗人IgG。IFA操作简便实用，但类风湿性关节炎和其他螺旋体病可出现假阳性反应。,6.动物试验,常用的实验动物有小白鼠，金地鼠和兔等。以螺旋体悬液感染，可出现与人类相似的皮损症状，血培养亦阳性，抗体效价显著升高，可作为良好的动物模型，常用新西兰白兔。 动物试验虽是一种经典的方法，但较繁琐

11、，有生物危害。,二、回归热疏螺旋体,是引起人类回归热的病原体。 根据回归热传播媒介不同，分为两类:一为虱传回归热，或称流行性回归热，其病原体为回归热疏螺旋体。另一为蜱传回归热热，又称地方性回归热。 我国流行的回归热主要是虱传型。,流行性回归热主要通过人体虱在人类中传播。当虱吸吮病人血液后，螺旋体从中肠进入血淋巴大量繁殖，不进入唾液或卵巢。人被虱叮咬后，因抓痒将虱粪压碎，经皮肤创伤进入人体。,侵入人体后，先在内脏繁殖，经一周左右的潜伏期，大量流入血液，引起菌血症型发热、肝、脾肿大，出现黄疽；持续一周左右，骤然退热，血中螺旋体消失，隔一周或数日又发热，血中出现螺旋体。如此反复发作与缓解可达310次

12、，故称回归热,取发热期外周血1滴，加盖玻片用暗视野显微镜观察，螺旋体运动活泼；为红细胞直径的2-4倍，螺旋稀疏不规则，呈波状。 如发热期未能查到螺旋体，取抗凝血01ml接种乳鼠腹腔，每日取尾静脉血镜检，13天可查到大量疏螺旋体。抗原易自发变异，使其血清学诊断十分困难。,三、奋森疏螺旋体,有38个不规则疏螺旋，形态与回归热螺旋体类似。G-，运动活泼。专性厌氧，常与梭杆菌寄生于牙龈部。 一般不致病，只有当人体抵抗力显著降低时，两种菌繁殖，协同引起奋森咽峡炎、牙龈炎、口颊坏疽、溃疡性口腔炎等。 用棉拭子从病灶处取材，涂片染色镜检，可见G-螺旋体与G-梭杆菌共存。,第四节 密螺旋体属,螺旋细密、规则两

13、端尖，数目多；包括致病性和非致病性两大类。 致病密螺旋体有苍白和品他密螺旋体两个种。,苍白密螺旋体又分3个亚种：苍白亚种、地方亚种和极细亚种，它们分别引起梅毒、是性传播疾病。地方性梅毒通过污染餐具传染，雅司病经直接接触患者皮肤受损部位而传染，二者的临床症状与梅毒相似，但不是性传播疾病。 品他密螺旋体引起人类品他病。,一、梅毒螺旋体,引起梅毒。人是惟一传染源。先天性梅毒通过胎盘由母体传染胎儿，获得性梅毒经性接触传播。也可经输血引起。 获得性梅毒，临床上分为三期：期无痛性硬下疳。多见于外生殖器；期梅毒疹，全身淋巴结肿大； 期损害全身组织和器官。,先天性梅毒，又称胎传梅毒。引起胎儿全身性感染，导致流

14、产或死胎；或出生呈现马鞍鼻、先天性耳聋等特殊体征。,微生物特性,1形态与染色 有814个致密规则小螺旋， 两端尖直运动活泼，G-，但不易着染。 Fontana镀银染成棕褐色。在光镜下易于 查见。在暗视野显微镜下，可观察标本形 态和运动方式。,2.电镜下观察，有细胞壁和细胞膜。细胞壁外有包膜，细胞膜内为含细胞质和核质的螺旋形原生质圆柱体。绕着34根周浆鞭毛或内鞭毛 ，与运动有关。 3.不能在无活细胞的人工培养基中生长繁殖。 4.抵抗力极弱。对温度和干燥特别敏感，4 3天死亡。 保存4 3天血液就无传染梅毒的危险。,梅毒螺旋体检验,1.直接显微镜检查 初期梅毒，取下疳分泌物；二期梅毒取梅毒疹、病灶

15、渗出物或局部淋巴结穿刺液，将上述检材置于玻片上用暗视野显微镜检查，如见有呈现运动活泼，沿其长轴滚动、屈伸、旋转、前后移行等的螺旋体即有诊断意义。,2.核酸检测,用PCR技术直接检测临床标本中梅毒螺旋 体的特异性DNA片段，用于检测的引物和 探针是编码外膜蛋白47kD的基因，其扩 增产物经斑点印迹，或电泳以Southern 印 迹法鉴定。,3.抗体检测,(1)非密螺旋体抗原试验 多用牛心肌的心脂质作为抗原，测定病人血 清中的反应素。初期梅毒病灶出现后1-2周时， 阳性率为5383，二期梅毒的阳性率可 达100，晚期梅毒的阳性率58-85，胎 传梅毒的阳性率为80- 100。,1)性病研究所实验室

16、 (VDRL)玻片试验,所用抗原(003心拟脂、021卵磷脂、09胆固醇，用无水乙醇配制)03ml加入装有03ml缓冲盐水的小瓶内(1015ml容积)，加塞混匀。再加24ml缓冲盐水即为抗原悬液，待检血清经56 30min灭活，滴加于玻片的漆圈内加等量抗原液，摇转玻片5min充分混匀反应后观察结果。有大片絮状凝聚物为 (3+)，中等凝聚物为(2+)，细小凝聚物为(+)，液体混浊为()。,2)快速血浆反应素环状 卡片试验(RPR),用活性炭颗粒吸附VDRL抗原。与反应素结合形成黑色凝集块，可肉眼观察结果。 取待检血清加于环状卡圆圈内，加VDRL抗原致敏活性炭1滴，旋转摇匀8min，观察结果。在白

17、色底板出现明显黑色凝集颗粒为阳性，试验结果用肉眼很容易判断，不需显微镜，也易于推广。,可将标本倍比稀释进行半定量试验。对评价疗效和判断是否再感染有价值。,(2)密螺旋体抗原试验,用密螺旋体抗原检测病人血清中特异性抗体，由于梅毒螺旋体、雅司螺旋体等抗原性相似，所以用血清学试验不可能区别这些密螺旋体及其所致疾病。,1)荧光密螺旋体抗体 吸收试验(FTA-ABS),先用吸收剂去除病人血清非特异性抗原，提高特异性，稀释成不同稀释度，加于预先涂有梅毒螺旋体抗原的玻片上，置湿盒内，37 孵育30min，洗片后再用荧光素标记的羊抗人丙球蛋白抗体，在荧光显微镜下观察。阳性者可见发荧光的梅毒螺旋体。FTA-AB

18、S试验具高度特异性和敏感性，在第一期梅毒的头几天就可测出特异性抗体。,2)梅毒螺旋体荧光抗体 双染色试验(FTAABS-DS),用 Nichol株梅毒螺旋体作抗原，用四甲基异硫氰酸若丹明结合的抗人球蛋白抗血清及异硫氰酸荧光素(FITC)结合的抗梅毒螺旋体球蛋白双重染色，用间接免疫荧光技术检测血清中的抗TPlgG抗体。,FTA-ABS-DS法无论对早期梅毒或晚期梅毒都有很高的敏感性和特异性，且阳性出现时间早。一期梅毒阳性率达90，晚期梅毒的阳性率为95。对确诊病人的敏感性和特异性分别为917和92o，但技术要求较高，且较费时费钱，因此多用于实验室试验。,3)抗梅毒螺旋体抗体的微量 血凝检测(MHA-TP),用抗原致敏红细胞作间接血凝试验是检测抗体最简易的方法，所用抗原是用梅毒螺旋体(Nichols株)提取物去致敏经醛化处理的绵羊红细胞，病人的血清先与非致病性Reiter细胞。血清若含有抗体则与这些细胞反应形成平铺孔底的凝集；用非致敏红细胞作对照，以除外非特异性凝集。,4)ELISA,用Nichols株为抗原，以超声波击碎。此法可用于各期梅毒诊断，灵敏度为96，对感染血清灵敏度为95。与荧光抗体双吸收法(FTA-ABS-DS)比较，两法符合率为96。 ELISA试剂具有价