双水相萃取技术good

1、1,双水相萃取技术,1.1 双水相系统 1.2 双水相中的分配平衡 1.3 影响物质分配平衡的因素 1. 4 双水相系统的应用,2,1.1 双水相系统,基因工程产品如蛋白质和酶往往是胞内产品，需经细胞破碎后才能提取、纯化，细胞颗粒尺寸的变化给固液分离带来了困难，同时这类产品的活性和功能对pH值、温度和离子强度等环境因素特别敏感。由于它们在有机溶剂中的溶解度低并且会变性，因此传统的溶剂萃取法并不适合。采用在有机相中添加表面活性剂产生反胶束的办法可克服这些问题，但同样存在相的分离问题。,3,有机溶剂萃取的不足： 许多蛋白质都有极强的亲水性，不溶于有机溶剂; 蛋白质在有机溶剂相中易变性失活。,双水相

2、萃取的优点: 使固液分离和纯化两个步骤同时进行，一步完成； 适合热敏物质的提取，主要是胞内酶； 亲水性聚合物加入水中，形成两相，在这两相中，水 分都占大比例（8595），这样生物活性蛋白质在两相中不会失活，且以一定比例分配于两相中。,4,聚合物的不相溶性(incompatibility)：当两种高分子聚合物之间存在相互排斥作用时，由于相对分子质量较大，分子间的相互排斥作用与混合过程的熵增加相比占主导地位，一种聚合物分子的周围将聚集同种分子而排斥异种分子，当达到平衡时，即形成分别富含不同聚合物的两相。这种含有聚合物分子的溶液发生分相的现象称为聚合物的不相容性。 可形成双水相的双聚合物体系很多，如

3、聚乙二醇(polyethylene glycol,略作PEG)/葡聚糖(dextran，略作Dx)，聚丙二醇(polypropylene glycol) / 聚乙二醇和甲基纤维素(methylcellulose)/葡聚糖等。双水相萃取中常采用的双聚合物系统为PEG/Dx，该双水相的上相富含PEG，下相富含Dx。除双聚合物系统外，聚合物与无机盐的混合溶液也可形成双水相。,5,双水相体系,6,a,双节线,系线,b,双节线,均相区,均相区,两相区,两相区,系线,临界点,图分别为PEG/葡萄糖(Dx)和PEG/磷酸钾(KPi)系统的典型相图,7,在系线上各点处系统的总浓度不同，但均分成组成相同而体积不

4、同的两相。两相的体积近似服从杠杆规则，即,系线的长度是衡量两相间相对差别的尺度，系线越长，两相间的性质差别越大，反之则越小。当系线长度趋向于零时，即在图b的双节线上K点，两相差别消失，任何溶质在两相中的分配系数均为1，因此K点称为临界点(critical point)。,8,1.2 双水相中的分配平衡,与溶剂萃取相同，溶质在双水相中的分配系数也用m=c2/c1表示。为简便起见，用c1 和c2分别表示平衡状态下下相和上相中溶质的总浓度。 生物分子的分配系数取决于溶质与双水相系统间的各种相互作用，其中主要有静电作用、疏水作用和生物亲和作用等。,lnm=lnme+lnmh+lnml,9,1.2.1

5、静电作用,10,11,实际的双水相系统中通常含有缓冲液和无机盐等电解质，当这些离子在两相中分配浓度不同时(即分配系数1)，将在两相间产生电位差，此时，荷电溶质的分配平衡将受相间电位的影响，从相平衡热力学理论推导溶质的分配系数表达式为,lnm=lnmo+FZ/RT,因此，荷电溶质的分配系数的对数与溶质的净电荷数成正比,由于同一双水相系统中添加不同的盐产生的相间电位不同，故分配系数与静电荷数的关系因无机盐而异.,12,1.2.2 疏水作用,PEG/Dx和PEG/无机盐等双水相系统的上相(PEG相)疏水性较大，相间的疏水性差用疏水性因子HF (hydrophoblc factor)表示。HF可通过测

6、定疏水性已知的氨基酸在其等电点处的分配系数maa测算,lnmaa=HF(RH+B),其中，RH为氨基酸的相对疏水性(relative hydrophobicity)， 是通过测定氨基酸在水和乙醇中溶解度的差别确定的，并设 疏水性最小的甘氨酸的RH0。所以上式中 B为,B = lnmGly/HF,13,pHpI时氨基酸在双水相系统中的分配系数与其RH值呈线性关系， 直线的斜率就是该双水相系统的HF值。,14,如果在pH为等电点的双水相中蛋白质的分配系数(m0)与HF值之间呈线性关系，则直线的斜率定义为该蛋白质的表面疏水性，用HFS (hydrophobic factor of solutes)表

7、示,lnm0=HF HFS,盐浓度对血红蛋白分配系数的影响 PEG/Dx,pH=pI;NaCl(mol/kg): () 0; () 0.6; () 1; () 2,从实验结果可知,蛋白质的表面疏水性HFS随添加 NaCl浓度的增大而增大.将盐对蛋白质疏水性的影 响引入上式，则,lnm0=HF( HFS+ HFS),式中， HFS为盐浓度增加引起的HFS值增量。因此：,lnm=HF(HFS+HFS)+ FZ/RT,该式较全面地描述了双水相系统的疏水性和相间 电位、蛋白质的疏水性和净电荷数对分配系数的 影响，同时也间接地通过盐对蛋白质表面疏水性 和相间电位的影响表现了盐对蛋白质分配系数的作用。,1

8、5,1.3 影响物质分配平衡的因素,聚合物的分子量 聚合物的浓度,分子量越小，蛋白质容易分配于富含该聚合物的相中。,当接近分配的临界点蛋白质均匀分配于两相中，分配系数接近1； 成相聚合物的总浓度或聚合物/盐浓度的比例增加时，系统远离平衡点，此时两相性质的差别增加，蛋白质容易趋向于某一极。,16,3. 盐的种类和浓度 4. pH值 5. 温度,盐的种类(离子组成)影响蛋白质、核酸等生物大分子的分配系数，盐浓度不仅影响蛋白质的表面疏水性，而且扰乱双水相系统，改变各相中成相物质的组成和相体积比。,pH值影响蛋白质的解离度，调节pH值可改变蛋白质的表面 电荷数，从而改变分配系数。,温度影响双水相系统的

9、相图，因而影响蛋白质的分配系数。 但一般来说，当双水相系统离双节线足够远时，温度的影响很小， 12度的温度改变不影响目标产物的萃取分离。,17,目前已知的胞内酶约2500种，但投入生产的很少。原因之一是提取困难。胞内酶提取的第一步系将细胞破碎得到匀浆液，但匀浆液黏度很大，有微小的细胞碎片存在，欲将细胞碎片除去，过去是依靠离心分离的方法，但非常困难。双水相系统可用于细胞碎片以及酶的进一步精制。,1. 双水相萃取法常用于胞内酶提取,1.4 双水相萃取的应用,18,利用双水相从细胞碎片中提取胞内酶的典型例子,19,双水相萃取技术在其它分离过程中的应用,20,细胞匀浆液,+PEG/盐（或葡萄糖）,PE

10、G/盐或PEG/Dx萃取系统,相分离,下相,上相（ PEG),(细胞碎片，杂蛋白，多糖，核酸）,（目标产物，杂蛋白，多糖，核酸）,+盐,PEG/盐萃取系统,相分离,下相,上相（ PEG),（杂蛋白，多糖，核酸）,（目标产物）,+盐,PEG/盐萃取系统,下相,（杂蛋白，盐）,相分离,上相,（PEG，目标产物）,三步萃取流程示意图：,21,要成功地运用两水相萃取的方法，应 满足下列条件： 欲提取的酶和细胞应分配在不同的相中； 酶的分配系数应足够大，使在一定的相体积比时，经过一次萃取，就能得到高的收率； 两相用离心机很容易分离。,22,2. 双水相反应,在双水相系统中进行转化翻译功能，如酶促反应，可以把产物移入另一相中，消除产物抑制，因而提高了产率。这实际上是一种反应和分离耦合的过程，有时也称为萃取生物转化；如果发生的是一种发酵过程，则也称为萃取发酵，因而此时也可以把双水相系统称为双水相反应器。,23,要进行两水相生物转化反应应满足下列条件： 催化剂应单侧分配； 底物应分配于催化剂所处的相中；产物应分配在另一相中；要有合适的相比。如产物分配在上相中，则相比要大，反之则相比要小。,这些条件不可能同时满足，分配理论也不