目的基因的获取

1、目标基因的获得：1 .目标基因是什么？目标基因的获取方式。聚合酶链反应的制备方法和过程。1.什么是目的基因：指基因工程操作所需的外源基因，即编码某种蛋白质的结构基因，如生物抗逆性基因和抗虫基因。从靶基因的概念来看，最原始的靶基因是指从某个甲类生物中直接获得的基因，然后转移到已知的乙类生物中并成功表达，使乙类生物能够表达甲类生物的某些特征。待克隆的DNA片段，编码某一蛋白质，研究某一基因的结构与功能之间的关系，研究某一基因与疾病之间的关系，2 .目标基因的获取、化学合成方法、基因组文库；CDNA文库、聚合酶链式反应、直接从染色体DNA中分离，3。聚合酶链反应扩增获得目标基因，1。聚合酶链式反应是

2、一种体外酶促合成特定基因片段的方法，它由高温变性、低温退火和在合适温度下延伸等几个反应组成，并在一个循环中进行，使目的基因能够快速扩增，具有很强的特异性和敏感性。聚合酶链式反应可以几何扩增特定的基因片段，并将染色体和聚合酶链式反应基因置于一个复杂的反应中。2.聚合酶链反应的基本原理和试管中的脱氧核糖核酸复制反应是基于脱氧核糖核酸半保守复制的机理；不同温度下体外脱氧核糖核酸分子的可变性和复性；通过人工控制体外合成系统的温度，双链脱氧核糖核酸变成单链，单链脱氧核糖核酸与人工合成的引物退火，脱氧核糖核酸聚合酶将引物沿着单链模板延伸成双链脱氧核糖核酸。3。聚合酶链反应过程，1)预变性：模板脱氧核糖核酸

3、的二级结构被完全打开，脱氧核糖核酸双链被完全解离，因此引物可以在第一次退火过程中尽可能多地结合到模板上。聚合酶链反应的预变性温度一般为94或95，预变性时间一般为3-5分钟。2)变性：使脱氧核糖核酸双链解离成单链。通常，9495，1分钟足以使模板变性。如果低于94，时间应延长，但温度不应太高，因为高温环境对酶活性有影响。3)退火(复性):引物与模板结合。退火温度是影响聚合酶链反应特异性的重要因素。退火温度取决于引物长度、碱基组成和浓度，以及目标基因序列的长度，通常在40至65之间。对于20个核苷酸来说，具有大约50% G C含量的引物，55是选择最佳退火温度的理想起点。引物复性温度的计算公式，

4、Tm(解链温度)4(G C) 2(A T)复性温度=Tm值(510)；在Tm值允许的范围内，选择较高的复性温度可以大大降低引物与模板之间的非特异性结合，提高聚合酶链反应的特异性；复性时间一般为3060秒，足以使引物与模板完全结合。4)延伸：在脱氧核糖核酸聚合酶的催化下，根据互补碱基配对的原理连续合成脱氧核糖核酸片段。延伸温度：一般选择7075，一般使用72。延伸温度过高不利于引物和模板的结合。延伸反应时间：根据待扩增片段的长度确定1Kb以内的DNA片段，延伸时间为1分钟(足够)。34kb的目标序列需要34分钟，10kb需要扩展到15分钟。如果延伸时间过长，会导致低浓度模板被非特异性扩增，延伸时

5、间会稍长。4.演示聚合酶链反应的反应过程，通过聚合酶链反应克隆基因的技术过程。设计引物提取基因组DNA用于电泳检测、聚合酶链反应、5.1设计引物，引物设计的原则：(1)序列应位于高度保守区，无与非扩增区同源的序列。(2)引物长度应为15-40 bp。(3)碱基尽可能随机分布，G-C占50-60%。(4)避免在底漆内部形成二级结构。(5)避免两个引物之间的互补序列。(6)t处的基底、限制性内切酶识别序列、启动子序列、定点突变探针标记、3、5、3、5、5.2基因组DNA的提取、模板DNA的来源：从微生物中提取的DNA和从植物中提取的DNA:从细胞中提取的DNA:血细胞、绒毛、尿样、毛发、精斑、口腔上皮细胞的固定和包埋组织样品：通过脱蜡和蛋白酶K消化的模板DNA的浓度：0.12微克/100微升体系的聚合酶链反应产量随着模板DNA浓度的增加而显著增加，这导致非特异性产物的增加。5，3聚合酶链反应，5，4聚合酶链反应体系和过程，反应体系模板(DNA或RNA)引物Taq DNA聚合酶10PCR缓冲液1.54 mM Mg2 0.2 mM