中药化学第五章-3.ppt

1、第四节 离子交换色谱 (ion-exchange column chromatography，IEC),离子交换色谱原理 离子交换色谱基本构成要素 影响离子交换的主要原因 离子交换色谱的操作技术 离子交换色谱的应用,一、原理 离子交换色谱法是以离子交换树脂作为固定 相，用水或水溶性溶剂作为流动相。在流动 相中的离子型成份与树脂上的同电荷离子进 行交换而被吸附，再用带有同种电荷的溶剂 进行洗脱，来分离离子型化合物的一种色谱 方法。,分离机理是利用样品组分的选择性系数不同而进 行分离。 R-A+B+ R-B+A+ 当平衡时： K= 若K1，说明树脂对B比A有更大的亲和力,B+树脂A+,A+树脂B+

2、,离子交换色谱,若以R代表离子交换树脂的母体，则其色谱分离的基本原理可表示为： 阳离子交换树脂 RSO3-H+Na+Cl- RSO3-Na+H+ + Cl- 阴离子交换树脂 RN+OH-Na+Cl- RN+Cl-Na+ + OH- 要求离子交换可逆，树脂可再生。,二、构成要素,（一）固定相 固定相是离子交换剂，分离子交换树脂和硅 胶化学键合离子交换剂两类。 离子交换树脂简介：立体网状结构的高分子 多元酸或多元碱的聚合物。 离子交换树脂的分子结构中，由两大部分构 成：稳定的网架及网架上的交换基。,1、分类： 根据交换基结合离子的性能不同将离子交换树脂分为两类： 阳离子交换树脂 阴离子交换树脂,商

3、品树脂的类型：钠盐（阳离子型）和氯型（阴离子型），而交换时用的是氢型和氢氧型。 阳离子交换树脂：强酸型SO3 弱酸型COOH、PO3H2 阴离子交换树脂：强碱型,2、组成 离子交换树脂由树脂母体和交换基团构成。常见的是聚苯乙烯树脂作为母体。,CH2CH2CHCH2CH2CH,SO3,CH CH2CH2CH,苯环SO3,有氢型和钠型,H+或Na+,H+或Na+,3、离子交换层析的原理：交换基上的活性离子（H+或OH-）在水溶液中与其它阴、阳离子的可逆交换来达到逐步分离的目的。,当两种（或两种以上）不同的可交换物质离子通过离子交换树脂柱时， 各不同成分的亲和力不同，在柱上的交换速度也不同，被洗脱的

4、时间也就不同，从而达到分离目的。,4、 离子交换树脂的性能： 交联度：离子交换树脂中所含的交联剂的 百分含量。 例如：上海树脂厂生产的聚苯乙烯强酸型 阳离子交换树脂，从其产品牌号：732（强酸 17）可以得知，交联度为7%（17）。 交联度越大，网眼越小、网隙越小，交换 的离子越小。,交换容量：单位质量的离子交换树脂中所含交换基团的毫摩尔数。单位为mmol/g。 交换容量是用来表示离子交换树脂进行交换离子的能力大小的，其数值大小决定于以树脂表面及网状结构内部所含的交换基的多少。 溶胀性：指树脂吸收水分后，浸润膨胀能力的大小,离子交换色谱,（二）流动相： 多是具一定pH和离子强度的缓冲溶液， 如

5、磷酸盐缓冲液。有时加入少量的有机溶 剂提高选择性，如甲酸、乙酸、碱等做成 的缓冲液。 （三）被分离成分： 必须能被分离成离子成分。即具有一 定的离子强度。,三、影响离子交换的因素,（一）成分 离子化程度越高越好。 （二）温度 越高越好，但要注意不能破坏成分。 （三）溶剂 极性越高越好。 （四）浓度 越低越好。,四、离子交换色谱的技术操作,树脂的预处理 装柱 上样交换 洗 脱,收集检查,树脂的再生,四、操作技术 （一）树脂的预处理 含义：将市售的含有杂质的树脂，处理去除杂质，并转为交换使用的类 型的过程。 方法：市售的阳离子交换树脂均为钠型，要转为氢型备用。 市售的阴离子交换树脂均为氯型，要转为

6、氢氧型备用。 1 、浸蒸馏水中12天。 2、10倍量2mol/lHCl 浸23h，再用蒸馏水洗至中性。 3、.NaOH.。 4、交叉重复1、2。 注意：阳树脂先2后3，三酸两碱，共五次。 阴32，碱酸，。,2、装柱： 柱底垫玻璃丝或脱脂棉，将事先用水溶胀并洗涤干净的离子交换树脂（如果是新购商品一定要先进行预处理，详细操作见树脂的预处理与再生）与水的混合物灌入柱内。 要求均匀、密实、无气泡。,3、 上样交换： 在柱顶放置一层玻璃丝，下端徐徐放液，同时将样品溶液慢慢倒入柱内。 注意：所加入的样品溶液中被交换成分的毫摩尔数，应与柱内所加的离子交换树脂的总容量相适应，经验比例为：加入量占总交换容量的阳

7、1/2、阴1/4，1/3。,4、洗脱： 用合适的洗脱剂从上端加入，使样品中各种不同的成分先后流出，分段定量收集洗脱液，可得单一成分的化合物。,规则：活泼离子优先交换到树脂上。,5、收集检查 6、树脂的再生： 树脂长期使用，当它的交换基大部分已经交换了离子后，就会失去交换能力而失效，需要适当处理使交换基上的已交换离子（如钙、镁离子等）变成可继续交换的游离型交换基离子（H及OH）。,方法：同预处理,五、离子交换色谱的应用,离子交换色谱时20世纪70年代发展起来的一种新的分析方法。主要用于能产生离子型的成分如氨基酸、肽类、生物碱、有机酸、酚类等成分的分离，并广泛应用于医药、环保（如水质的测定）、食品

8、等多种行业。,第五节 凝胶色谱,凝胶色谱概念 凝胶色谱原理 凝胶色谱构成要素 凝胶色谱的类型 凝胶色谱的操作技术,第五节 凝胶色谱 一、凝胶色谱概念 以多孔凝胶为固定相的柱色谱。 二、原理： 利用凝胶的三维网状结构的分子筛的过滤作用，使分子大小不同的成分，可以达到相互分离的目的。,凝胶，是在水中不溶、但可膨胀的球形颗粒，具有三维空间的网状结构。 当在水中充分膨胀后，装入色谱柱中，加入样品混合物，用同一溶剂洗脱时， 样品 凝胶,由于凝胶网孔半径的限制，大分子将不能渗入凝胶颗粒内部（即被排阻在外）而在颗粒间隙移动，并随溶剂一起柱底流出； 小分子因可自由渗入并扩散到凝胶颗粒内部，故通过色谱柱时阻力增

9、大、流速变缓，将较晚流出。 故凝胶色谱按分子由大到小的顺序流出分离。,大分子,小分子,凝胶颗粒,凝胶排阻示意图解,三、凝胶色谱基本构成要素,基本要素： 固定相、流动相、被分离成分的溶液。,（一）固定相多孔凝胶 1、分类 （ 1 ）软质凝胶如葡聚糖凝胶、琼脂糖凝胶等，适用于水为流动相。 （ 2 ）半硬质凝胶如苯乙烯二乙烯基苯交联共聚凝胶（交联聚苯乙烯凝胶）是应用最多的有机凝胶，适用于非极性有机溶剂。 （ 3 ）硬质凝胶如多孔硅胶、多孔玻珠等，多孔硅胶是用得较多的无机凝胶。,2、葡聚糖凝胶的结构 葡聚糖与甘油基通过醚桥并联而成的多孔网状结构。,3. 葡聚糖凝胶的性质,极性：葡聚糖分子内含有大量羟基

10、 稳定性：由于醚键的不活泼性 ，不溶于水和盐溶 液，在碱性和弱酸性溶液中性质稳定 ， 但在酸性溶液中高温加热能促使糖苷键 水解。和氧化剂接触会分解，长期不用 宜加防腐剂。,4、葡聚糖凝胶的型号 GX G：葡聚糖凝胶 X：1克干凝胶吸水量的10倍 不同型号的性能及应用 型号数字越大，吸水量越大，凝胶体积膨胀越大，孔隙也越大， 可用于大分子物质的分离；反之，可用于小分子物质的分离。 G型凝胶用于流动相为水的色谱分离。另外，LH型凝胶应用围更广，极性、亲水性和亲脂性流动相中均可应用。,（二）流动相,亲脂性溶剂：氯仿、甲苯。 极性和亲水性溶剂：水、水溶液。 选用原则： 分离脂溶性成分，选用亲脂性溶剂为

11、流动相。 分离水溶性成分，选用极性和亲水性溶剂为 流动相。,四、凝胶色谱类型,凝胶过滤色谱：水为流动相 （GFC）； 凝胶渗透色谱：有机溶剂为流动相(GPC) 。,五、凝胶色谱操作技术,凝胶的预处理 装柱 上样 洗脱 收集、检查 凝胶的再利用,凝胶的预处理 将干凝胶用选好的流动相（或溶剂）充分浸泡膨胀后被用。 装柱 一般选择直径为2.5 cm的柱子。凝胶装入柱中，放出溶剂，再用溶剂不断流洗柱子，使凝胶沉集、柱床稳定，并始终保持一定的液面。 上样 把需要分离的成分溶于选好的溶剂中，上样前为防止破坏柱床表面，要在 柱床表面放一张滤纸。上样方法同一般柱色谱。 洗脱 洗脱剂和浸泡凝胶所用的溶剂相同。

12、收集 分段收集，定性检查，合并同一组分，再进行精制。 凝胶的再利用 可反复使用，无需再生。,六、应用,分离分子大小不同的化合物。 分离大分子-广泛应用。 分离小分子，或其他方面(脱盐、吸水浓缩、除热源、测定分子量)-也有应用。,第六节 大孔吸附树脂色谱,大孔吸附树脂色谱的概念 大孔吸附树脂色谱的原理 大孔吸附树脂色谱基本构成要素 影响分离的主要因素 大孔吸附树脂色谱的操作技术 大孔吸附树脂的应用,一、概念 吸附剂和分子筛应用的柱色谱。 二、原理 吸附性：范德华引力、氢键 分子筛性：渗透、过滤,三、构成要素,（一）固定相 1、分类：极性、非极性 2、性质：大孔网状的高分子吸附剂 3、选用：根据成

13、分的极性和分子大小 如分离大分子的物质选择能使大孔吸附树脂体积膨胀大的溶剂。反之，选用使其体积膨胀小 的溶剂。,（二）流动相,1、种类： 2、选用原则： 非极性大孔吸附树脂：选择流动相极性越小，洗脱力越强。反之亦然。 一般上样后先用水（或酸、碱水）洗去杂质，然后用不同浓度的含水醇、甲醇、乙醇、丙酮等依次洗脱。,四、影响因素,极性大孔树脂：极性大的或分子小的成分吸附力强。 非：小大,五、操作技术,树脂的预处理：丙酮加热回流除杂质， 装柱 上样 洗脱 收集、检查,六、大孔吸附树脂的应用,大孔吸附树脂主要应用于中药化合物的分离和富集工作。如多糖和苷类物质的分离，黄酮苷、生物碱、三萜类化合物的分离和精

14、制，并广泛应用于其它各个领域。,第七节 高效液相色谱（high performance liquid chromatography，HPLC）,近十几年来发展起来的一种快速、灵敏、高效的分离技术。 特点是： 使用的固定相支持剂颗粒很细，因而表面积很大；溶剂系统采用高压，因此洗脱速度增大。 多种类型的柱层析都可用HPLC来代替，例如分配层析、离子交换层析、吸附层析以及凝胶过滤等。,高效液相色谱的概念 高效液相色谱（HPLC）又称高压液相色谱或高速液相色谱，是利用高压的手段加快液体流动相流速，采用高效能固定相及高灵敏度检测器发展起来的现代液相色谱法。 高效液相色谱的原理 包括前面讲过的分配原理、吸附原理、离子交换原理和分子筛过滤、渗透原理。,高效液相色谱的类型 按分离原理不同分为 分配色谱 吸附色谱 离子交换色谱 凝胶色谱 按固定相和流动相极性选择不同分为 正相色谱 反相色谱,高效液相色谱的主要组成 主要包括：溶剂槽、高压泵、进样器、色谱柱及高灵敏度的检测器、数据处理器等。,溶剂槽,高压泵,梯度淋洗,进样器,色谱柱,检测器,收集器,记录器,应用 只要求试样能制成溶液，而不需要气化