紫外可见光谱与荧光光谱.ppt

1、紫外-可见光谱和荧光光谱分析方法，郭毅2009-4-3，主要内容，光谱发生光谱仪的基本结构，光谱分析的操作方法，光谱发生：辐射跃迁，光吸收和光发射，分子电子光谱：基态分子吸收光跃迁到电子激发态的光物理过程，电子激发态通过光与分子的相互作用发射光跃迁到基态，吸收光谱，发射光谱，(紫外-可见吸收光谱)，(荧光光谱，磷光光谱)，电子吸收光谱和分子电子发射光谱为研究分子的结构，能量和动力学提供了重要信息(1)光谱的产生，什么是光？为什么分子吸收光？光谱产生的原理。图：电磁波(小有机分子的“尺寸”比波长小得多)。作为电磁波，它可以对带电粒子(如电子和原子核)和磁偶极子(如电子自旋和核自旋)施加电力和磁力

2、。光是一种电磁波，可以认为是由交变电场和交变磁场在光传播方向上相互垂直的两个平面上相互作用而成。理解光和分子之间相互作用的关键概念是光的振荡电场可以使电子运动，也就是说，被激发的电子表现得像一个振荡偶极子。在分子电子云的任何给定点，光波引起的电场强度变化将是时间的函数，即零(吸引)最大值零(产生相反的场)(排斥)最大值零，重合(正负中心)分开，图：电场感应的偶极矩、I、I，净效应：瞬时偶极矩， 偶极光和分子之间的相互作用取决于共振能量：E=E h=HC/光子能量：E=hv h:普朗克常数6.62617610-34焦耳秒v:频率c:光速3360波长，电子能级的基本特征之一：能级的量子化，电子跃迁

3、能级的差约为1-20 eV，kT=25 meV系统的热能尺度比分子的振动能级差大几倍。 电子跃迁所处的波长范围(能量)和电子跃迁的类型如下：(1)*跃迁是指成键轨道上的电子吸收光子并被激发跃迁到*反成键轨道上；(2)N *跃迁是指分子中非成键轨道上的N个电子吸收能量后再向后移动到*反成键轨道上；(3)*跃迁是指不饱和键；(4)N *跃迁是指非成键轨道上的N个电子吸收能量后跃迁到*反成键轨道上。(2)与光吸收和光发射光谱相关的一些基本概念。你做过吸收光谱和发射光谱吗？你为什么做吸收和发射光谱学？你对吸收和发射光谱了解多少？吸收光谱和测量基态分子M吸收一个能量为H的光子，使占据轨道的电子跃迁到空轨

4、道，处于电子激发态M*。这种光激发过程可以用MhM*表示。通过测量吸收光谱，可以确定与跃迁相关的两个轨道之间的能级间隔。吸收光谱以吸收的光子能量(波长、波数和能量eV)为横坐标，吸收度d或log为纵坐标，给出分子对不同能量光子的吸收特性。吸收的光子能量等于激发态的能量。吸光度，吸收的光子能量(波长、波数和能量EV)，消光系数为：摩尔。它是评价物质吸收光的能力的一个重要物理量。I0:入射光强度I3360透射光强度是分子的一个基本性质，它与物质的种类和入射光的波长有关，而不取决于浓度和光程长度。它的大小与过渡是否满足选择规则密切相关。朗伯定律表明，入射光被透明介质吸收的百分比与入射光的强度无关。比

5、尔定律(激光光源除外)表明，吸收的光量与光路中吸光分子的浓度成正比。朗伯比尔定律，(稀溶液)，答：吸收值波长、波数和eV之间的能量转换关系如下：(cm1)=1/(cm)=1107/(nm)e(eV)=1240/(nm)，od=log (i0/I)，(1)吸光度或光密度1%透射率或99%吸收，98%透射率或2%吸收，吸收强度用光谱带的峰值或积分强度表示。用来表示积分强度的物理量是振荡器强度：=4.321094.32109最大值1/2，其中最大值是峰摩尔消光系数，1/2是半峰宽度。积分吸收强度与描述电子跃迁的基本理论单位振动强度有关，最大允许跃迁强度为1。利用这个方程，我们可以计算任何吸收带的振动

6、强度，并将其与1进行比较，以判断产生该带的电子跃迁是允许的还是禁止的。一些基本概念，(1)发色团：分子中能吸收紫外光或可见光的结构系统称为发色团或发色团。C=C，C=O，CC等。是发色团。不同的发色团有不同的电子跃迁类型。(2)辅色基团：一些原子或基团本身不能吸收光波，但当它们与某些发色团相连时，它们可以移动发色团产生的吸收峰。这些原子或基团被称为辅助发色团。例如，-羟基，-NH2，-巯基和一些卤素。由于引入取代基或改变溶剂，有机化合物的吸收带经常改变最大吸收波长max和吸收强度。最大：向长波方向的移动称为红移，向短波方向的移动称为蓝移(或紫移)。如图所示，吸收强度，即摩尔吸收系数增加或减少的

7、现象分别称为着色效应或减色效应。吸收光谱测量装置示意图：光源发出的多波长连续光经单色仪分光，按波长顺序进入样品池。光电倍增管和光子计数器测量透过样品池的透射光强度，计算机控制操作并处理数据。在双光路系统中，一条光路是溶剂池，另一条光路是样品池。穿过单色仪的单色光交替穿过两个吸收池，以测量对数(I0 /I)随波长的变化。吸收光谱仪，双路分光光度计的光学系统，机械旋转P使单色光按波长从长波到短波的顺序连续通过出射狭缝(S2)和光电倍增管(PbS光电池长波)。实验操作是相关的。吸收池包括应时池和光学玻璃池。应时池在紫外可见区和近红外区有较高的透过率，可以测量紫外可见吸收光谱和近红外吸收光谱，而光学玻

8、璃在紫外区有吸收(区分吸收池)，各种有机溶剂在紫外区吸收，吸收端波长(nm)如下：乙腈(190)、水(191)、戊烷(190)、己烷(195)、异辛烷(197)、环己烷(198)、甲醇(203)、乙醇(204)、乙醚(215)和二氯甲烷苯(278)这些吸收带的长波区域是溶剂透射光的可用光谱区域。溶剂的极性影响吸收带的位置。(纯化溶剂)光致电子的激发态非常活跃，可以通过分子内辐射和非辐射跃迁回到基态，并可以通过分子间能量转移、电子转移和与猝灭剂的化学反应猝灭。发射光谱和测量，荧光光谱的基本原理，分子的激发和失活：所有电子自旋都成对的分子的电子状态。大多数有机分子的基态是单线态。当处于基态的一对电

9、子中的一个被激发到更高的能级时，它的自旋方向不会立即改变，分子仍然处于单重态。三态：两个电子的自旋不成对且平行的状态。受激三重态的能量低于受激单重态的能量。，Jablonski图，发射光谱，磷光光谱，荧光光谱，非辐射跃迁振动弛豫：内部转换：系统间交叉：外部转换：荧光，磷光，荧光光谱当荧光发射光谱由荧光发射光谱和荧光激发光谱确定时，激发单色仪用于固定激发光波长ex，此时只有ex波长的光子进入样品池，使基态分子M处于M*。M*发出的光被发射单色仪分光，给出了光强随波长变化的曲线。在测量荧光激发光谱时，选择发射光谱中的某一发射波长em作为观察波长，测量不同波长的激发光对发射观察波长的贡献。发射光、荧

10、光光谱仪、激发光谱和荧光光谱。荧光光谱的特征是斯托克斯位移。与激发光谱相比，荧光光谱的波长总是出现在较长的波长上；荧光光谱与激发波长无关。无论用250纳米还是350纳米作为激发光源，荧光光谱的形状和峰的位置都是相同的。吸收光谱和发射光谱近似镜像对称。em: ex202ex20ex: em/220em20，(3)吸收光谱和发射光谱的形状、Abs、em、A原子、b低压气相刚性分子、溶剂分子、典型实例、紫外吸收光谱的应用，以及物质的紫外吸收光谱基本上是发色团和发色团在其分子中的特征，而不是整个分子的特征。如果物质组成的变化不影响发色团和发色团，就不会显著影响它们的吸收光谱。例如，甲苯和乙苯具有相同的

11、紫外吸收光谱。此外，溶剂的变化等外部因素也会影响吸收光谱，一些化合物的吸收光谱精细结构会消失，在极性溶剂中成为一个宽带。因此，物质的分子结构不能只靠紫外光谱来完全确定，只有配合红外吸收光谱、核磁共振光谱、质谱等化学和物理方法才能得出可靠的结论。1、化合物，有机化合物的分子骨架是否包含共轭结构体系，如CCCC、CCCO、苯环等。可以用紫外光谱推断出来。用紫外光谱鉴别有机化合物远不如用红外光谱有效，因为许多化合物在紫外光下没有吸收或只有微弱的吸收，而且紫外光谱一般比较简单，没有特征。紫外光谱可用于检测某些具有大共轭体系或发色官能团的化合物，也可作为其他鉴定方法的补充。如果一种化合物在紫外区是透明的

12、，这意味着分子中没有共轭体系，也没有醛基、酮基或溴和碘。它可以是脂肪烃、胺、腈、醇和其他没有双键或环状共轭体系的化合物。如果在210-250纳米处有强吸收，它可能包含具有两个双键的共轭体系，如共轭二烯或-不饱和酮。在260、300和330纳米处也有高强度吸收带，这意味着有三个、四个和五个共轭体系。如果在260300纳米(2001 000)处有中等强度的吸收，这意味着系统中可能有苯环。如果苯环上有共轭发色团，它可以超过10 000个。如果在250-300纳米处有一个弱吸收带，它可能含有简单的非共轭发色团，如羰基。2纯度测试，如果有机化合物在紫外可见区没有明显的吸收峰，而杂质在紫外区有很强的吸收，

13、则可以用紫外光谱测试化合物的纯度。如果有机化合物在紫外和可见光区没有明显的吸收峰，杂质在紫外区有很强的吸收，可以用紫外光谱来检查化合物的纯度。在相同的条件下，制备样品溶液和标准溶液，在最佳波长下测量样品A和标准品A的吸光度，进行比较，计算被测组分I的浓度2.1比较法，2.2标准曲线，制备一系列不同浓度的标准溶液，在最佳位置测量标准溶液的吸光度A，然后画出一条以浓度为横坐标、相应吸光度为纵坐标的标准曲线，在完全相同的条件下测量供试品溶液的吸光度，从标准曲线中得到供试品溶液的浓度。该方法适用于大量样品的测定。朗伯-比尔定律朗伯-比尔定律是紫外-可见吸收光谱法定量分析的理论基础。它的数学表达式是：

14、A=1 C，4。氢键强度的测定。当溶剂分子与溶质分子结合形成氢键时，对溶质分子的紫外光谱有很大影响。对于羰基化合物，根据极性溶剂和非极性溶剂中吸收带的不同，可以近似测量氢键的强度。当溶剂分子与溶质分子结合形成氢键时，溶质分子的紫外光谱受到很大影响。对于羰基化合物，根据极性溶剂和非极性溶剂中吸收带的不同，可以近似测量氢键的强度。紫外/可见光谱在蛋白质研究中的应用，通过浓度测定研究构象变化，相互作用的研究，蛋白质骨架的紫外吸收，肽键在250 nm的远紫外区有很大的吸收，蛋白质浓度测定表明190 nm比280nm大100倍，但溶剂吸收也很大，溶剂吸收也很大。1毫米，0.1毫米，0.1毫米，二硫键在250纳米附近有弱吸收，色氨酸，酪氨酸和苯丙氨酸，根据蛋白质序列可以预测蛋白质的消光系数。ProtParam:/tools/protparam.html,Tyr吸收光谱与酸碱度有关，酸碱度滴定可用于确定Tyr是环境的内极性还是外极性，最大值在酸碱度6: 274纳米，最大值在酸碱度1: 295纳米，蛋白质构象变化的研究，聚赖氨酸盐酸：随机线圈在酸碱度6.0，25的吸收光谱(粗体)；-酸碱度为10.8、25时的螺旋(虚线)；-在pH 10.8，52C(虚线)下的链。蛋白质折叠/变性研究、核糖核酸酶、荧