目的基因的获得.ppt

1、制备目的基因的获得、目的基因：分离、改造、扩增或表达的基因。 获得目的基因是实施基因工程的第一步。 查询密码需要克隆复制的DNA片段、某蛋白质，研究某基因的结构与功能的关系，研究某基因与疾病的关系，目的基因的获得方法、化学合成法、染色体组DNA活动拉力赛cDNA活动拉力赛、聚合酶链式反应、直接从染色体DNA中分离， DNA的提纯方法很多，根据萃取目的、种类、所用生物、组织材料、实验条件等而定，其中最常用的是碱萃取法。 第一节DNA的提取和纯化、一、质粒DNA的提取、plasmid DNA、thegenomicdnaofe.coli 3360 asinglecirculardoublestran

2、deddna withthecontourlengthabout 8 (1)原理，1 .碱裂解法形成质粒DNA、DNA双链、变性、DNA单链、复性、强碱、中性、染色体线性DNA或缺失质粒DNA变性后双链分离，形成无复性交织的结构，蛋白质第一头地：溶菌，50 mM葡萄糖，25mm t 、10 mM EDTA、4-5 mg/ml溶菌工作团队、RNase A、溶液II破坏胞质膜，使蛋白质和DNA变性的第二步：破膜、蛋白质和DNA变性、Solution II成分：第三步：中和，溶液III使DNA反复，蛋白质sds复合体和染色体DNA solution成分：0.2 N NaOH，1.0%SDS，3M冰乙

3、酸纳米金属钍(冰冰乙酸调节pH为4.8 )，(3)用试剂作用，溶血工作团队可水解作用细胞细胞贴壁主要化学成分肽聚葡萄糖中的-1。 在碱性条件(pH8)下有活性。 葡萄糖增加溶液的黏性系数，维持渗透压，防止DNA因机械功率(振动)而分解。 EDTA、Mg2、Ca 2的鳌合剂抑制DNA酶催化剂的活性，防止DNA的分解。 提供NaOH-SDS、NaOH :强碱、pH12的碱条件，使DNA双链改性。 SDS:溶解胞质膜蛋白质和细胞球内蛋白质，结合“蛋白质-SDS”复合物，使蛋白质(包括DNA酶催化剂)变性沉淀。 冰冰乙酸将冰乙酸纳米金属钍溶液的pH调节到4.8。 用于中和NaOH改性液，使DNA复原。

4、 高浓度的NaAc有利于改性的大分子(蛋白质、DNA、RNA等)的沉淀。 用于使DNA沉淀，如果乙醇、DNA分子以水合状态“溶解”到水中，乙醇就会夺走DNA分子的水环境。 分解NaAc-HAc缓冲液、RNase A、RNA残渣。 使提取的DNA中不含有小分子的RNA。TE缓冲液、DNA保存液。 用Tris-HCl和EDTA制备。 Tris-HCl不含金属络离子(与磷酸缓冲液和硼酸缓冲行业不同)，有利于后续操作的EDTA抑制DNA酶催化剂，防止DNA被酶催化剂分解。 提取蛋白质改性剂，进而提取DNA溶液中的蛋白质，使蛋白质沉淀。 但是苯酚会残留在DNA溶液中。 (目前多采用各种商品化的色谱分析法

5、柱纯化DNA。苯酚-三氯甲烷、可选、这些个的试剂有商业试剂盒，也可在自各儿配制。 最重要的是，2 .影响质粒DNA产量的因素，菌株遗传背景质粒自身的拷贝数，一般endA基因使用变异大肠菌群菌株。 例如，DH5、JM109、XL1-Blue等。 (1)接纳体菌株、endA基因查询密码了核酸内切离酶催化剂，在Mg2的存在下可以将双链DNA消化成7bp的寡聚核苷酸片段。 是直接决定DNA产量的重要因素之一。 (3)质粒大小、分子量大的质粒、复制数少。 (2)质粒的复制数，取决于质粒本身的性质。 二、染色体组DNA的提取，一般过程和原理：1 .细菌染色体组DNA的制备，(1)细胞分裂，10%SDS和蛋

6、白酶k。 37 oC温育。 不要NaOH！ 注意，(3)使DNA沉淀，使体积的0.6倍的异丙醇沉淀。 (2)DNA精制、CTAB (十六烷基三甲基铵溴化物)粗多糖、酚三氯甲烷异戊醇去除蛋白质。 一般过程和原理： (1)将组织粉碎，用液氮冷冻后，研磨成微粉末。2 .植物DNA的提取采用CTAB法，(2)细胞球分解，2%CTAB/2-ME (十六烷基三甲基铵/2巯基乙醇)。 或者1% SDS和蛋白酶k。 65 oC温育。 使用0.6倍体积的异丙醇(-20 oC )。 (3)纯化DNA，用苯酚和苯酚三氯甲烷提取除去蛋白质污染。 (4)使DNA沉淀，(5)去除RNA污染，使用RNase A。 (可加入

7、1/10体积的3M冰乙酸阿摩尼亚辅助沉淀) 。 三、DNA的定量和纯度测定、1 .紫外光谱法、DNA (或RNA )在260nm波长处有特异的紫外吸收峰。 原理：蛋白质在280nm处有吸收峰，溴化乙锭(EB )可插入DNA分子，在紫外光照射下会发出红色荧光。 2、琼脂糖凝胶电泳估计、原理：与已知浓度的DNA阳离子电泳波段荧光强度对比，可估计DNA含量。 一般采用琼脂糖凝胶电泳，与已知分子量的DNA标准混合液进行对比后得知。 DNA分子量Marker有很多公司的商品，使用方便。 例如DNA的Hind酶催化剂切断物等。 四、DNA分子量的估计值、Marker、Marker、DNA ladder、

8、在1979年，一九七九年H. G. Khorana提出了用化学方法合成基因的构想，第二节化学合成目的基因为1，已知目的基因2 .分子量小的目的基因的制备：从已知的氨基酸排列顺序推测可能的DNA序列，*从化学合成法中获得目的基因，一方面，现在常用的方法，磷酸二酯类化合物法，亚磷酸三酯类化合物法，固相合成法，自动合成法。磷酸三酯类化合物法、保护dNTP的5末端p或3末端-OH、酸或碱的脱保护、(1)原理、1 .磷酸二酯类化合物法、带保护的一元酸连接、保证合成反应的取向进行。5保护的一元酸和3保护的另一个一元酸通过磷酸二酯类化合物键连接。 (2)在合成过程中，接下来的5端保护的一元酸可以与3端保护的

9、二氯化学基酸聚合。 合成的寡聚核苷酸链的3末端先以3oh与不溶性载体，例如多孔玻璃珠(CPG )连接，然后从35个方向加入核苷酸单体。 所用核苷酸单体的活性官能化学基受到保护，具体合成和延伸过程如图所示。 二、亚磷酸三酯类化合物法、原理、化学合成的DNA片段一般在200bp以内。 二、化学合成DNA片段的组装是用T4多核苷酸激酶使各片段5端具有磷酸，1 .用互补连接法，预先合成的片段间有互补区，不同片段间的互补区形成有程序断点的完全双链，(2)5端磷酸化，(1)互补对， (合成的T4多核苷酸激酶是将5oh磷酸化、将完整的DNA双链、(3)连接酶完全双链、2 .互补地连结的连结法，在预先修正的片

10、段之间存在局部互补区域，可以相互不同、5、3、T4DNA连接酶、Klenow片断、引物、1 .直接合成基因，(2)有些基因比较短，化学合成费用低，DNA合成器，5 .合成人工接头或连接物，合成各种酶催化剂切割点人工接头(Adaptor )或连接物(Linker ) 第3节PCR法放大目的基因，(1)序列已知状况，(2)序列未知状况，(1)pcr的发明。 2. 1985年Cetus公司的科学家K. B. Mullis发明了PCR，使这一构想成为现实。 1. 1971年Khorana提出体外将DNA复制到人造的的构想，但当时由于引物、DNA多聚酶和DNA测序技术未得到解决，构想未能实现。Polym

11、erase Chain Reaction，一、PCR方法介绍，3. Taq DNA多聚酶，1988年R. K. Saiki将Taq DNA多聚酶用于PCR反应。 使PCR自动循环修正成为可能。 4. PCR修订，1988年Cetus公司发明了自动热循环修订。 1986年H. A. Erilish从嗜热活菌中分离出了耐高温的Taq DNA多聚酶，PCR技术已进入实用阶段，取代了大肠菌群DNA多聚酶Klenow片段(37 oC ) 在合成于ACGTACGTA、TGCATGCAT、ATCTTGAAC、3、5、3、3、5、5 ATCTTGAAC、3、5、TAGAACTTG、ACGTACGTA、3、人造

12、的的单链DNA的小片段中，盐化学基序列被放大的铸造模型DNA 2. DNA数字大板块和引物可恢复性，数字大板块盘，数字大板块盘，ATCTTGAAC，5，3，ACGTACGTA，5，3，引物，引物，引物TAGAACTTG，ACGTACGTA，3，数字大板块盘，数字大板块盘，atcttgggta 4. 1个循环的结果，5 .新循环开始、DNA elongation、(3)pcr的过程，1 .第一一头地变性(denature )、94、2 .第二步骤反复(anneal )、50-60次1分钟、引物优先和数字大板块盘反复。 引物浓度高，引物链短。 94下1分钟，新合成的DNA双链体变性为单链铸造模型。

13、 4 .第四阶段改性，72下12分钟，Taq DNA多聚酶在引物的3端加入核苷酸。 3 .第三步延长、5 .第五步重复、第二步第三步第四步、复原性、延长、变性、95 5min、50 1min、72、(4)PCR的特征是：1.专一性强，PCR专用地合成拉伸过程在高温下进行。 2、易感性高，这避免了一般的DNA多聚酶污染和非引物延伸引起的DNA。 提高了反映的专一性。 理论上，一条模链可以在32个循环内合成约109条，RT-PCR :数字键小大板块纯度要求低。 5.mRNA可以扩增；4 .简便，用反转录酶将mrna合成cDNA，然后以cDNA为铸造模型进行扩增。 3 .快速完成整个PCR过程，约1

14、-4小时。 不需要精制，也可以直接使用细菌。 固定或包埋的组织切片也可直接作为数字大板块。 二、已知序列基因的分离，(1)已知序列是DNA片段，例如defenderagainstapoptoticcelldeath (led ad1)序列，根据研究的目的，通过已知DNA序列修订对应的引物，直接ppm 目前，世界主要的基因库为： (1)EMBL，是设置在欧洲分子生物学实验室的基因库，其网络地址为：3358 www.ebi.AC.uk/ebi-home.html。 (2)Genbank是设在美国国家卫生研究院(NIH )的基因池，其网际网络上的地址是33603358 www.NCBI.NLM.NIH.gov/web/search/inddi (3) Swiss port和trement Swissport是蛋白质序列库，所包含的序列的精度相对较高，但TREMBL只包含从EMBL库翻译的序列。 LeDAD1序列，(2)已知序列为mRNA mRNA时：首先分离(或纯化) mRNA A:从mRNA序列直接设定引物。 B:根据mRNA序列设定引物和OligoT/A引物，进行PCR扩增C:逆转录，以得到的cDNA为铸造模型进行PCR扩增。1、序列已有其他物种报