药学中的生物技术和方法抗体和免疫分析.ppt

1、II -免疫分析法Immunoassays,国际抗体药物,2009年美国市场上的抗体药物成为生物技术药物销售额最大的类别。 2010年美国市场的单抗药物销售额为185亿美元 2011年，全球单抗药物的市场总量已经达到628亿美元， 世界范围内的单抗药物销份额约是整个生物制药市场份额的36%。,国内抗体药物,目前我国的上市抗体品种中,国外进口单抗占据多数 2011年国内市场规模超过10亿元 我国抗体药物产业化的主要限制因素： 动物细胞大规模培养技术已成为各个国家生物医药产业化的核心竞争点 抗体下游纯化成本已占45%到70%高质量纯化工艺研究刻不容缓 QbD（质量源于设计）理念的应用,Antibo

2、dy and structure,特点：2个基因决定一个蛋白质 与抗原的结合力强，高度专一性,抗原和抗原决定簇,一个抗原分子上可能有数个抗原决定簇 每個 抗原决定簇至少誘生一种专一性抗体 蛋白质抗原的决定簇含有六个以上氨基酸,。,克隆选择学说,单抗和多抗,多克隆抗体（polyclonal antibody）指由不同B细胞产生的针对多种抗原决定簇的多种抗体混合物，如免疫血清。 单克隆抗体（ monoclonal antibody）指由一种 B 细胞生产，针对某一抗原决定簇的单一抗体。,Preparation of polyclonal antibodies,传统抗血清,抗 原,免 疫,混合抗体,

3、1,2,3,4,免疫前要先把抗原作成乳剂,约在两月內 注射五到八次,Preparation of monoclonal antibodies,Preparation of recombinant antibodies,淋巴细胞,总RNA,抗体轻、重链文库,重组单链抗体基因,轻、重单链基因,大肠杆菌表达体系,单链抗体,单链抗体,在重链与轻链之间加上一段连接肽，连成一条单链 如果仅是两条链的可变区，称为ScFv 连接肽的长度在10-15个氨基酸左右，不宜太长或太短，它应具有柔软性，侧链少，抗原性弱等特点。常用的连接肽是GGGGS3,Ab as antigen- Primary and second

4、ary antibody,Primary Ab,Secondary Ab,Primary Ab,Protein A,二抗针对一抗的物种特异性,Protein A针对所有动物抗体Fc,Immunoassays,The most important biological assays for: Identification of proteins and small bio-molecules Quantification for complex biological sample without separation Powerful separation High sensitivity, s

5、pecificity and accuracy,抗体的标记方法,放射性同位素标记 酶标记 荧光标记 有机分子荧光标记 绿色荧光蛋白标记 稀土荧光标记 通用标记,放射性碘标记,HRP酶标记,简单化学偶联方法： 1过碘酸钠法：仅用于HRP的标记。HRP是一种糖蛋白，过碘酸钠可将与酶活性无关的多糖羟基氧化为醛基，再与抗体蛋白的游离氨基结合，结合反应后，再加人硼氢化钠(NaHB4)还原后，形成稳定的HRPCH2NHIgG酶标记物。为防止酶蛋白氨基与醛基反应发生自身偶联，常在标记前知用二硝基氟苯(DNFB)封闭酶蛋白上的和氨基。 2戊二醛交联标记法：戊二醛具有两个活性醛基，分别与酶分子和抗体分子上的氨基

6、结合。,NaHB4,HRP,Labeling with isoFITC,GFP labeling,GFP gene,ScFv gene,expression,GFP gene,Protein A gene,expression,Ab-Fc,通用标记,+,Avidin/streptA,+,Anti-digoxin Ab,2nd Ab,Protein A,Primary Ab,Primary Ab,Important assays,Immunostaining Western blot Fluorescent microscopy Quantification of immunostaining

7、Quantitative assays: Radioimmunoassay, RIAcompetent binding Fluorescence immunoassay, FIA FPIA-homogeneous assay TRFIA Enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA,Immunostaining,Fluorescence/luminescence,Colorization,or,组织切片或培养细胞单层,细胞/组织固定,免疫染色,（荧光）显微镜观察,免疫荧光标记的c-Myc,phalloidin荧光标记的微丝,荧光染色的细胞核,合成图像,Imm

8、unoblot - Western Blot,Electroblotting,gel,PVDF membrane,Immunostaining,封闭,分析 抗体,显色抗体,显色,数字化灰度 图像分析,0.5 1 2 4 6 8 12 16 24 30 (h),c-myc,p53,Cyclin D1,Actin,CaN,CaM:La3+,HRP,StreptAvidin,Biotin,RIA Assay,免疫竞争结合分析-小分子抗原分析的基本方法,Ag + Ab AgAb + Ag + * Ag * AgAb + * Ag,*AgAb: Precipitant,放射性计数,常用分离沉淀技术,盐析

9、法：饱和硫酸铵、硫酸钠 聚乙二醇法（w=6000） 特点： 快速，价廉，来源方便，受环境影响大 抗体免疫沉淀法 特点： 分离完全，非特异结合小，环境影响小，效价高，但成本高 固相吸附剂,RIA测量步骤,恒量的* Ag、Ab加入反应管中 加入待测样品、或标准品（已知浓度） 37或4 温育 加入分离剂分离结合及游离部分 测定以总放射性为分母，测定* AgAb 为分子，计算结合%，以结合率为纵坐标，浓度为坐标，制作标准曲线 待测样品的结合率从标准曲线上求出浓度,Calibration curve,ELISA（Enzyme Linked ImmunoSorbent Assay）,Sandwich EL

10、ISA,竞争法（略）,High Convenience High Sensitivity,96-well plate,包被,封闭,结合,显色,酶标仪测定,hv,洗涤,洗涤,洗涤,终止,酶的底物,HRP的底物,氧化产物(橙红色),492nm吸收,2mol/L硫酸终止反应,AP的底物 硝基苯磷酸酯 对硝基酚(黄色) NaOH终止反应 405nm吸收峰,磷酸4-甲基伞酮 （荧光底物）,荧光偏振免疫分析,Principle of fluorescence polarization,emitting dipole,absorbing dipole,excitation light polarized a

11、long z,x,z,y,I,I,detector,Fluorescence polarization immunoassay,Ag + Ab AgAb + Ag + * Ag * AgAb + * Ag,High polarized fluorescence,Low polarized fluorescence,偏振度r,时间分辨荧光免疫分析,荧光背景和常用探针分子的荧光寿命,Lanthanide labeling,Lanthanide labeling,Ligand labeling,CTTA,BCPDA,镧系荧光底物法,DELFIA法,荧光试剂标记可以消除环境中稀土污染造成的荧光背景,固

12、相时间分辨荧光,分子印迹和核酸适配体,思考题,什么是抗体？其结构特征是什么？怎么由基因编码一个抗体？ 什么是抗原决定簇？一个抗原分子是否只有一个抗原决定簇？ 抗体与抗原结合的特异性如何？为何有如此高的特异性？ 抗体有哪些应用？ 什么是抗体的Fab片段和Fc片段？其结构分别是如何？ 什么是单抗和多抗？分别是如何制备的？哪一种抗体的特异性高？为什么？ 什么是抗体库？ 什么是单链抗体？什么是ScFv？如何制备单链抗体？单链抗体有何应用？ 什么是二抗？二抗与一抗如何结合的？如何选择使用二抗？ 什么是Protein A？它如何与抗体结合的？ 什么是免疫分析？免疫分析有哪些特点？有哪些主要类型的免疫分析？ 抗体标记有哪些种类和方法？ 有哪几种通用抗体标