第五章 种子的扩大培养.ppt

1、第五章 种子的扩大培养,种子扩大培养的目的与要求,种子制备实例,种子制备的技术概要,关键词： 种子，要求，制备，扩大,第一节 种子扩大培养的目的与要求,种子扩大培养的概念:,种子扩大培养是指将保存在砂土管、冷冻干燥管中处休眠状态的生产菌种接入试管斜面活化后，再经过扁瓶或摇瓶及种子罐逐级扩大培养,最终获得一定数量和质量的纯种过程。这些纯种培养物称为种子。,种子扩培的目的,接种量的需要,菌种的驯化,缩短发酵时间、保证生产水平,种子的要求：,总量及浓度能满足要求,生理状况稳定，个体与群体,活力强，移种至发酵后，能够迅速生长,无杂菌污染,第二节 种子制备过程举例,一、谷氨酸生产的种子制备,制备过程,斜

2、面菌种, 一级种子培养, 二级种子培养, 发酵,1、斜面 (AS1.299),培养基：蛋白胨 1%，牛肉膏1%，氯化钠 0.5 琼脂 2%， pH 7.0-7.2,培养基特点：有利于菌体的生长，原料比较精细,培养条件：32，生长18-24小时,生长斜面要求：生长良好，所使用斜面连续传代不超过3次,2. 一级种子（摇瓶）,培养条件： 于1000 mL三角瓶中，装液200-250 mL，32培养12小时。,培养基：葡萄糖2%，尿素0.5%，玉米浆 2.5%，K2HPO4 0.1%,培养基特点：有利于菌体的生长，所使用的原料已经基本接近于发酵培养基,3. 二级种子(种子罐),培养条件：在种子罐中培养

3、（容积为发酵罐的1%(10%)），32培养7-10个小时,培养基：和一级种子相似，其中葡萄糖用水解糖代替，浓度为2.5%,培养基的特点：长菌体，更接近于发酵培养基,种子的质量要求：,108-109个/mL 大小均匀，呈单个或八字排列 pH 7.0-7.2 时结束，6.8 8 7.0-7.2 活力旺盛,二、青霉素生产的种子制备,制备过程,安瓿管, 斜面孢子, 大米孢子, 一级种子, 二级种子, 发酵,1. 斜面孢子,培养基：甘油、 葡萄糖、 蛋白胨等,培养基特点：有利于长孢子，用量少而精细,培养条件：25、7天，注意湿度50%左右,2. 大米孢子,培养基：大米及氮源（玉米浆）,培养基的特点：成本

4、低、米粒之间结构疏松提高比表面积和氧的传质，营养适当（要求大米的白点小）有利于孢子的生长。,培养条件：25、7天，控制湿度,大米孢子的要求：1粒米含1.4106个孢子,3. 一级种子,培养基：（葡萄糖、乳糖、蔗糖）、玉米浆,目的：长菌体,培养条件：27，40小时,接种量：200亿孢子/吨,4. 二级种子,培养基：同上,培养条件：27、10-14小时,接种量：10%,种子的质量要求,菌丝长稠呈丝状、菌丝团很少，有中小空孢，处于期,青霉素发酵菌丝体的生长共分为6个期，1-4为年青期，4-6期合成青霉素的能力最强,第三节 种子制备的技术概要,一、种子制备的过程,实验室阶段：不用种子罐，所用的设备为培

5、养箱、摇床等实验室常见设备，在工厂该培养过程在菌种室完成，因此形象地将该培养过程称为实验室阶段的种子培养。,生产车间阶段：种子培养在种子罐里进行，在工厂归为发酵车间管理，因此形象地称这些培养过程为生产车间阶段。,实验室阶段,1. 培养物选择的原则,目的：种子扩培到一定的量和质，根据菌种的特点最终的培养物可分为两类,A. 对于不产孢子和芽孢的微生物 获得一定数量和质量的菌体,对于不产芽孢和孢子的微生物，实验室阶段的种子扩培最终是获得一定数量和质量的菌体，如谷氨酸的种子培养。,获得一定数量和质量的孢子,菌丝体培养步骤少，因而更容易获得量和质稳定的种子，但操作繁琐。,B. 对于产孢子的微生物,获得一

6、定数量和质量的菌丝体,便于操作，但需要更仔细的控制。,2. 培养基选择的原则,培养基的选择应该是有利于菌体的生长，对孢子培养基应该是有利于孢子的生长。,在原料方面，实验室种子培养阶段，规模一般比较小，因此为了保证培养基的质量，培养基的原料一般都比较精细。,3. 起始接种物的传代问题,细菌,保藏斜面 活化斜面,产孢子,保藏 母斜面 子斜面,目的：使菌种的传代次数尽可能的少。,生产车间阶段,1. 培养物的选择原则,在生产车间阶段，最终一般都是获得一定数量的菌丝体。,缩短发酵时间,有利于获得好的发酵结果,菌丝体比孢子要有利：,2. 培养基选择的原则,目的：获得一定数量和质量的菌体，因此培养基的选择应

7、首先考虑的是有利于孢子的发育和菌体的生长，所以营养要比发酵培养基丰富。,在原料方面：不如实验室阶段那么精细，而是基本接近于发酵培养基，这有两个方面的原因: 一是成本 二是驯化,例：柠檬酸发酵,以蔗糖为原料,成分 斜面 种子罐 发酵 麦芽汁 麦汁 蔗糖 2.5-5% 20% NH4NO3 0.225% 0.11% K2HPO4 0.03% MgSO4.H2O 0.025% 0.025% KCl 0.015% 琼脂 2%,薯干粉,成分 斜面 种子罐 发酵 麦芽汁 麦汁 薯干粉 10% 22-28% (NH4)2SO4 0.5% 琼脂 2%,3. 发酵级数的确定,谷氨酸：三级发酵,一级种子（摇瓶）二

8、级种子 （小罐）发酵,青霉素：三级发酵,一级种子 （小罐）二级种子（中罐）发酵,一般由菌丝体培养开始计算发酵级数，但有时，工厂从第一级种子罐开始计算发酵级数,发酵级数确定的依据,级数受发酵规模、菌体生长特性、接种量的影响,级数大，难控制、易染菌、易变异，管理困难，一般2-4级。,在发酵产品的放大中，反应级数的确定是非常重要的一个方面,采用三级种子的谷氨酸发酵工艺 李文东， 发酵科技通讯，2003,7,斜面一级种子（1200ml/5000ml三角瓶）二级种子（2m3）三级种子（20m3)发酵（240m3),背景：二级种子小种量（种子罐是发酵罐的1%左右）,三级种子大种量（种子罐是发酵罐的5%以上

9、）,文章：三级种子工艺,培养基成分表,三级种子的特点： 种量更大，生长速度快：, 糖酸转化率高且稳定,4. 接种量的确定,移入种子的体积 接种量 接种后培养液的体积,过大过小都不好，最终以实践定，如大多数抗生素为7-15%。但是一般认为大一点好。,双种：两个种子罐接种到一个发酵罐中。,倒种：一部分种子来源于种子罐，一部分来源于发酵罐。,接种量对菌体形态和产亚麻酸的影响 杨博， 中国油脂，2002,亚麻酸是人体必需多价不饱和脂肪酸，是人体前列腺素的前体，在预防与治疗心脑血管疾病、糖尿病治疗、增强免疫力、抗癌和保护皮肤等方面具有重要作用。发酵法生产亚麻酸成了当今研究的一个热点。,采用被孢霉进行亚麻酸发酵时接种量可以明显影响菌丝体,采用被孢霉进行亚麻酸发酵时接种量可以明显影响菌丝体的形态，从而影响菌体干重和亚麻酸产量。,不同接种量影响菌体的生长和发酵,发酵前期发酵液作为种子，发酵指数明显提高 发酵后期菌体自溶明显，影响提炼收率,20%种子罐10%发酵罐前期发酵液效果最好,5. 种龄,指种子罐中培养的菌体开始移入下一级种子罐或发酵罐时的培养时间。,种龄短：菌体太少； 种龄长：易老化。,原则：对数生长期末，细胞活力强，菌体浓度相对较大，但是最终由实验结果定。,舒琴， 林产化学与工业，2004,镜检：24小时多个杆