细菌的培养及鉴定

1、细菌培养及鉴定,标本采集原则,1.及时采集微生物标本作病原学检查 2.在抗菌药物使用前采集标本 3.采样时严格执行无菌操作 4.标本容器须无菌，但不得有消毒剂 5.采样后立即送检 6.送检标本应注明来源和检验目的,咳痰方法,病人先漱口，清洁口腔，去除表面的菌群 病人深咳，收集从下呼吸道咳出的痰液 无痰可用35NaCl 5ml雾吸约5min导痰 以清晨第二口痰为佳 标本采集后放置时间不超过2小时,清洁中段尿液,尽量取早晨第一次尿液 嘱患者留取标本的前一天晚上少饮水 女性病人 收集标本前用肥皂水冲洗外阴，再以灭菌清水冲洗尿道口 排出几毫升后，不停止尿流，采集中段尿 男性病人 翻转包皮，清洗尿道口

2、排出几毫升后，不停止尿流,采集中段尿 采集标本后立即送检！,哥伦比亚血平板营养要求高的细菌 巧克力平板含V、X因子，主要培养嗜血杆菌、脑膜炎球菌和淋球菌用 中国蓝/麦康凯平板G-杆菌用 SS平板沙门氏菌和志贺氏菌用 M-H平板细菌药敏用 TCBS平板弧菌科细菌用 沙包氏平板真菌培养用 真菌显色平板真菌培养用 罗氏培养基分枝杆菌用,常用的培养基种类和用途,临床标本培养基选择,血： 血培养瓶 中断尿：血平板、mac平板 脑脊液：血培养瓶、血平板、巧克力平板 穿刺液：血培养瓶、血平板、巧克力平板、mac平板 胆汁：血平板、巧克力平板、mac平板 大便:.麦康凯、SS、血平板,细菌接种的基本程序,灭菌

3、接种环,沾取标本,接种,灭菌接种环,细菌接种法,平板划线接种法： 目的：使混合的细菌呈单个分散生长，形成单个菌落，以便获得纯菌。 方法： 分区划线法：适用于含菌量较多的标本 连续划线法：适用于含菌量较少的标本,分区划线法(3区),第一区划线,灭菌接种环,第二区划线,灭菌接种环,第三区划线,灭菌接种环,连续划线法,细菌培养法,一般培养（需氧培养）： 培养温度：35（采用恒温培养箱） 培养时间：1824h 二氧化碳培养法：烛缸法、二氧化碳培养箱 厌氧培养法：厌氧培养箱、厌氧袋、厌氧罐、疱肉培养法、硫乙醇酸盐法等,细菌在固体培养基中的生长现象,菌落 定义：指单个细菌在平板培养基上生长繁殖，形成单一肉

4、眼可见的细菌集团。 菌落特征：大小、形状、边缘、颜色、表面、透明度、湿润度、黏度、溶血性 菌落类型：光滑型（S）、粗糙型（R）、黏液型（M） 菌苔：指多个菌落融合在一起形成的细菌堆积物。,菌 落,菌落与菌苔,菌落的三个类型：,1.光滑型菌落（Smooth type Colony） ：又称S型 2.粗糙型菌落（Rough type Colony）：又称R型 3.粘液型菌落（Mucoid type Colony）又称M型,2020/7/17,16,S型菌落,R型菌落,M型菌落,革兰染色,原理：通过结晶紫初染和碘液媒染后，在细胞壁内形成了不溶于水的结晶紫与碘的复合物，革兰氏阳性菌由于其细胞壁较厚、肽

5、聚糖网层次较多且交联致密，故遇乙醇或丙酮脱色处理时，因失水反而使网孔缩小，再加上它不含类脂，故乙醇处理不会出现缝隙，因此能把结晶紫与碘复合物牢牢留在壁内，使其仍呈紫色；而革兰氏阴性菌因其细胞壁薄、外膜层类脂含量高、肽聚糖层薄且交联度差，在遇脱色剂后，以类脂为主的外膜迅速溶解，薄而松散的肽聚糖网不能阻挡结晶紫与碘复合物的溶出，因此通过乙醇脱色后仍呈无色，再经复红等红色染料复染，就使革兰氏阴性菌呈红色。,革兰染色步骤,涂片包括涂片、干燥、固定三步。 涂片 干燥 固定,固定的目的：,使细菌的细胞凝固，使菌体与玻片粘得更牢固； 可改变菌体对染料的通透性； 加热固定可杀死细菌，比较安全。,结晶紫 1 碘

6、液 1 95%乙醇 30” 复红1 冲洗 滤纸干燥 油镜观察,冲洗,冲洗,冲洗,革兰染色程序,初染,媒染,脱色,复染,紫色（G）,革兰氏染色步骤示意图,革兰染色,甲菌,乙 菌,初染,结晶紫,媒染,碘液,脱色,乙醇,复染,稀释复红,紫色（G）,红色（G-）,革兰染色步骤示意图,【结果】,细菌被染成紫色者，称为革兰阳性菌； 而细菌染成红色者，称为革兰阴性菌；,阳性菌紫色（G+b) 阴性菌红色（G-b),G+ 球菌,显微镜下的杆菌,G-杆菌,Figure 2 - Gram stain of Gram - E. coli cells,痰标本涂片染色低倍镜下分类,分级 白细胞（个） 上皮细胞（个） A

7、25 25 25 A、B两种情况的痰适合做培养，C不合格，应重新留标本,革兰染色注意事项,标本涂片不宜太厚 固定不宜过热 脱色不宜过度 选用培养18-24小时菌龄的细菌为宜,抗酸染色,原理：分枝杆菌细胞壁含脂质较多,其中主要成分为分枝菌酸,此物具有抗酸性,染色时与石炭酸复红结合牢固,能抵抗酸性乙醇的脱色作用,因此抗酸菌能保持复红的颜色,达到染色目的。,抗酸染色步骤,1、涂片包括涂片、干燥、固定三步。 涂片 干燥 固定,抗酸染色步骤,2、染色包括初染、脱色、复染三步。,石炭酸复红维持 3-5 3%盐酸酒精30 1 美蓝复染1 冲洗 干燥 油镜观察,冲洗,冲洗,初染,脱色,复染,抗酸染色结果,抗酸

8、菌呈红色， 常堆积成团， 排列无序， 偶呈分枝状生长。 背景及非抗酸性细菌呈兰色。,抗酸杆菌报告,300个视野仅见到18条抗酸杆菌填写条数 1+：镜检查见3-9条抗酸杆菌/100高倍镜视野 2+：镜检查见19条抗酸杆菌/10高倍镜视野 3+：镜检查见1-9条抗酸杆菌/高倍镜视野 4+:镜检查见9条抗酸杆菌/高倍镜视野,抗酸染色注意事项,染色充分 脱色时间宁长勿短 在涂抹痰标本时严禁对载玻片进行加热,临床标本培养基选择,生殖道标本根据临床医生所写的检验项目接种相应的平板及操作： 淋球菌培养接种淋球菌平板;念珠菌培养接种沙保罗培养基；支原体培养则按支原体培养的操作规程操作；作普通培养则接种血平板和

9、巧克力平板,观察细菌在平板上的生长现象,血平板：大小、形状、边缘、颜色、表面、透明度、湿润度、黏度、溶血性 mac平板：大小、形状、颜色、透明度、湿润度、黏度 巧克力平板：大小、形状、颜色、透明度、湿润度、黏度,2020/7/17,37,革兰阴性菌 葡萄球菌,细菌的初步分类,细菌的分离与纯化：自血平板挑出待检菌株的单菌落进行初步的鉴定。如果混有杂菌，应该重新转种分纯。 染色与镜检： 首先通过革兰氏染色确定基本的分类：（1）G+球菌（2）G-球菌（3）G-杆菌（4）G+杆菌。此外，如果镜下发现革兰氏染色阳性、椭圆形、有芽孢状的较大菌体，可能是真菌。,金黄色葡萄球菌,最重要的致病葡萄球菌 血平板上

10、菌落有明显溶血环，颜色呈金黄色、灰白色或柠檬色 分解葡萄糖、麦芽糖、蔗糖和甘露醇 血浆凝固酶和DNA酶阳性,2020/7/17,41,葡萄球菌,念珠菌显色培养基,绿色白色念珠菌 蓝色热带念珠菌 白色其他，细菌被抑制 紫色光滑 粉色克柔假丝酵母菌,嗜血杆菌的鉴定途径,只能在营养条件高的巧克力平板上生长，菌落为中等大小、圆形、灰白色、透明 革兰染色：G-小杆菌 卫星实验就可以帮助初步鉴定,2020/7/17,48,嗜血杆菌,奈瑟氏菌属鉴定,在血平板和巧克力平板上生长，mac上不生长 血平板形成灰色、湿润、透明或半透明、不溶血的菌落 巧克力平板上形成圆形、灰蓝色的似露滴状菌落 革兰染色： G-双球菌

11、，呈肾形或咖啡豆形，凹面相对 氧化酶和触酶都均为阳性,奈瑟氏菌属有11个种，临床就淋病奈 菌和脑膜炎奈瑟菌 最为重要,奈瑟氏菌属鉴定流程,菌落观察：灰色、湿润、透明或半透明、不溶血 涂片染色：G-双球菌，呈肾形或咖啡豆状 氧化酶试验+ 触酶+ + 麦芽糖 - 脑膜炎奈瑟菌 淋病奈瑟菌,细菌的鉴定与药敏,卫生部重点监控的6种MDRO,MASA:耐甲氧西林金黄色葡萄球菌 判断标准：对苯唑西林耐药或头孢西丁诱导实验阳性 CRAB：耐碳青霉烯鲍曼不动杆菌 判断标准：对亚胺培南或美罗培南耐药 VER：耐万古霉素肠球菌 判断标准：对万古霉素耐药,ESBLs：产超广谱内酰胺酶细菌。包括：大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌、产酸克雷伯菌等 判断标准：对第3代和第4代头孢菌素和氨曲南耐药 CRE:耐碳青霉烯类肠杆菌科细菌 判断标准：对亚胺培南等碳青霉烯类耐药 MDR/XDROA:多重耐药/泛耐药铜绿假单胞菌 判断标准：对亚胺培南等碳青霉烯类耐药,临床常见问题,痰涂片与痰培养结果不一致？ 培养和涂片选择的痰液不同；标本采集时间过长，部分苛养菌死亡； 选择药敏结果敏感的药物，临床治疗无效？ 体外药敏试验只能预测体内治疗效果，并不等同；一般来说，耐药=治疗无效，敏感治疗有效,今天培养结果与前天结果不一样？ 1）取材是否规范？ 2）痰标本有时候选择优势菌做，可能结果 不一样 3）抗生素的使用 鉴定结果为四联