药物定量分析与分析方法验证解析

1、第四章 药物定量分析与分析方法验证,4.1 定量分析样品的前处理方法,概述 含金属或卤素的药物，在分析前需要经过不同方法处理后，方可进行测定。处理方法因金属或卤素在分子中结合的牢固程度而异。,一、含卤素有机药物的分析,含卤素有机药物系指药物分子结构中所含卤素直接与芳环或脂肪链相连者，而不包括某些有机药物的卤酸盐或氢卤酸盐,结构特点：CX,（一）卤原子的活泼性,1. 卤原子与碳原子直接相连，卤原子的活泼性和它直接相连的烃基的结构有很大关系,（1）乙烯型卤和芳卤 不活泼,（2）烯丙型卤和苄卤 活泼,（3）卤代烷型 介于两者之间,2. 分子中所含卤原子的个数,分子中所含卤原子的个数越多，活泼性越强，

2、特别是同一碳上含多个卤原子或一个苯环上含多个卤原子时，活泼性增强更加明显,3. 卤素的种类,IBrClF,常见的含卤素有机药物,三氯叔丁醇 防腐药 镇痛药,六氯对二甲苯 广谱驱虫药,泛影酸 X线造影剂,胆影酸 X线造影剂,碘他拉酸 X线造影剂,碘番酸 X线造影剂,碘苯酯 X线造影剂,盐酸胺碘酮 抗心律失常药,诺氟沙星 广谱抗菌药,醋酸氟轻松 肾上腺皮质激素类药，抗炎及抗过敏,磺溴酞钠 实验诊断用药 （肝功能）,（二）含卤素有机药物的分析,直接回流后测定法,碱性或酸性还原后测定法,氧瓶燃烧分解后测定法,1. 直接回流后测定法,本法是将含卤素有机药物溶于适当溶剂（如乙醇）中，加入氢氧化钠溶液（或一

3、定量过量的硝酸银滴定液）后，加热回流使其水解，将有机结合的卤素转变为无机的卤素离子，然后采用银量法（Volhard法）测定。,本法适用于含卤素有机药物结构中卤素原子结合不牢固的药物（如卤原子和脂肪碳原子相连者）。,原理 三氯叔丁醇在NaOH溶液中加热回流水解，氯元素全部转变成NaCl， 用剩余滴定法，即于水解液中加HNO3酸化， 再加入定量过量的AgNO3滴定液，使Cl-生成AgCl沉淀， 过量的AgNO3，以Fe3+为指示剂，用NH4SCN液回滴定。,例：三氯叔丁醇的测定 ChP （2005）,（淡棕红色）,(Ksp=1.561010 ),(Ksp=1.010-12 ),Fe3+ + SCN

4、 Fe (SCN) 2+,测定方法 取本品约0.1g，精密称定，加乙醇5ml溶解后，加20%氢氧化钠溶液5ml，加热回流15min，放冷至室温，加水20ml与硝酸5ml，精密加硝酸银滴定液(0.1mol/L) 30ml，再加邻苯二甲酸二丁酯5ml，密塞，强力振摇后，加硫酸铁铵指示液2ml，用硫氰酸铵滴定液(0.1mol/L)滴定，并将滴定的结果用空白试验校正。每1ml硝酸银滴定液(0.1mol/L)相当于6.216mg的C4H7Cl3O1/2H2O。,反应摩尔比为13,T滴定度，每1ml滴定液相当于被测组分的mg数 c滴定液浓度，mol/L M被测物的摩尔质量，g/mol n1mol样品消耗滴

5、定液的摩尔数，常用反应摩尔比体现，即反应摩尔比为1n,2.经氧化还原后测定法 (1)碱性还原后测定 卤素结合于芳环上时，由于分子中碘的结合较牢固，需在碱性溶液中加还原剂（如锌粉）回流，使碳-碘键断裂，形成无机碘化物后测定。 (2)酸性还原后测定法,两法均是将含卤素有机药物在碱性或酸性下，加还原剂（如锌粉）加热回流，药物产生还原裂解反应，使有机结合的卤素转变为无机的卤素离子，然后采用银量法（Fajans法）测定。,本法适用于测定结构中碘与苯环直接相连，且一个苯环上含多个碘原子的含卤素有机药物。,泛影酸,（1） 碱性还原后测定法,例 泛影酸的测定 ChP (2005),取本品约0.4g，精密称定，

6、加氢氧化钠溶液30ml与锌粉1.0g，加热回流30min，放冷，冷凝管用少量水洗涤，滤过，烧瓶与滤器用水洗涤3次，每次15ml，洗液与滤液合并，加冰醋酸5ml与曙红钠指示液5滴，用硝酸银滴定液(0.1mol/L)滴定。每1ml硝酸银滴定液(0.1mol/L)相当于20.46mg的C11H9 I 3N2O4。,USP (24)、BP（1998）,ChP(2005)收载的胆影酸、碘番酸、胆影葡胺、泛影葡胺、碘他拉酸等均采用同法测定。,碘番酸,（2）酸性还原后测定法,取本品的干燥品约0.4g，精密称定，加锌粉1g及冰醋酸10ml，加热回流30min，放冷，冷凝管用水30ml洗涤，用脱脂棉过滤，烧瓶与

7、脱脂棉用水洗涤2次，每次20ml，洗液与滤液合并，加四溴酚酞乙酯指示液1ml ，用硝酸银滴定液(0.1mol/L)滴定。终点时黄色沉淀变为绿色。每1ml硝酸银滴定液(0.1mol/L)相当于19.031mg的C11H12 I 3NO2。,例 碘番酸的测定 JP (13),3. 氧瓶燃烧分解后测定法,（1）原理,氧瓶燃烧法：将有机药物放入充满氧气的密闭燃烧瓶中进行燃烧，并将燃烧所产生的欲测物质吸收于适当的吸收液中，然后根据欲测物质的性质，采用适宜的分析方法进行鉴别、检查或含量测定,适用于含卤素、硫、氮、硒等有机药物的分析,本法特点是简便、快速、破坏完全，尤其适用于微量样品的分析,（ 2） 仪器与

8、材料,仪器装置 燃烧瓶为500、1000或2000ml无色、磨口、厚壁、硬质玻璃锥型瓶；瓶塞空心，底部熔封铂丝一根，下端呈螺旋状或网状,称样用材料及称样 A. 固体样品 无灰滤纸 B. 液体样品 纸袋,C. 软膏类样品：将适量样品置不含被测成分的蜡油纸中包裹严密，外层再用无灰滤纸包裹,氧瓶燃烧法装置与样品包装操作图,吸收液,A. 作用：吸收液的作用是将样品经燃烧分解所产生的各种价态的卤素、硫、氮、硒等，定量地吸收并转变为一定的便于测定的价态,氧气,B. 吸收液的选择,氟 水 氯 NaOH溶液 溴 H2O2-NaOH NaOH-硫酸肼饱和溶液 碘 NaOH硫酸肼饱和溶液 硫 NaOH或H2O2

9、硒 硝酸溶液,（3）操作方法,燃烧瓶燃烧前的准备 用洗液洗净后，按各药品项下的规定加入吸收液，将瓶口用水湿润，小心急速地通入氧气1min，立即用表面皿覆盖瓶口。 样品的准备 取样品适量，精密称定后按规定方法包裹，固定于铂丝下端的网内或螺旋处。,样品的燃烧 点燃包有供试品的滤纸尾部，迅速放入燃烧瓶中，按紧瓶塞，加水少量封闭瓶口，俟燃烧完毕（应无黑色碎片），充分振摇，使生成的烟雾完全吸入吸收液中，放置15min，用水少量冲洗瓶塞及铂丝，合并洗液及吸收液，同法另做空白试验。然后按各药品项下规定的方法进行鉴别、检查或含量测定。,根据被燃烧分解的样品量选用适宜大小的燃烧瓶。,（4）注意事项,ChP（20

10、05）规定的燃烧瓶体积为500、1000或2000ml三种，采用常量或半微量分析,正确选用燃烧瓶的目的在于： 样品能在足够的氧气中燃烧分解完全； 有利于将燃烧分解产物较快地吸收到吸收液中； 防止爆炸的可能性。,测定含氟有机药物时，用石英制 燃烧瓶,铂丝燃烧时起催化作用,应同时做空白试验,燃烧时要注意防爆,燃烧要完全,燃烧产生的烟雾完全被吸收,（5）应用,例 磺溴酞钠的含量测定 ChP (2005),燃烧分解,O2,HBr + Na2S + Na2SO4 + ,溴 取本品约0.2g，照氧瓶燃烧法（附录 C）进行有机破坏，选用1000ml燃烧瓶，以0.4%氢氧化钠溶液10ml，浓过氧化氢溶液0.5

11、ml与水10ml作为吸收液，俟生成的烟雾完全吸入吸收液后，用水稀释至100ml，煮沸5分钟，放冷，加稀硝酸使成酸性，精密加硝酸银滴定液（0.1mol/l）20ml，摇匀，再加硫酸铁铵指示液2mL，用硫氰酸铵滴定液(0.1mol/L)滴定，并将滴定的结果用空白试验校正。每1mL硝酸银滴定液(0.1mol/L)相当于7.990mg的溴(Br)。,例 碘苯酯的含量测定 ChP（2005）,原理 碘苯酯系有机碘化物，用氧瓶燃烧分解，转变为碘化物，继而氧化为游离的I2，并被定量地吸收于吸收液中，和NaOH反应，生成I-与IO3-，加入Br2-CH3COOH溶液，使全部转变为IO3- ，过量的溴以HCOO

12、H及通空气去除。加入KI，使与IO3-反应析出游离I2，用Na2S2O3液滴定， I2与淀粉结合所显的蓝色消失即为终点,取本品约20mg，精密称定，照氧瓶燃烧法进行有机破坏，用氢氧化钠试液2ml与水l0ml为吸收液，待吸收完全后，加溴醋酸溶液(取醋酸钾10g，加冰醋酸适量使溶解，加溴0.4ml，再加冰醋酸使成1000m1)l0ml，密塞，振摇，放置数分钟，加甲酸约lml，用水洗涤瓶口，并通入空气流约35min以除去剩余的溴蒸气，加碘化钾2g，密塞，摇匀，用硫代硫酸钠滴定液(0.02 mol/L)滴定，至近终点时，加淀粉指示液，继续滴定至蓝色消失，并将滴定的结果用空白试验校正。每lml的硫代硫酸

13、钠滴定液(0.02mol/L)相当于1.388mg的C19H29IO2。,滴定度的计算 放大反应,2mol碘苯酯1molI2 1molI21molNaIO+1molNaI 1molNaIO1/3molNaIO3+2/3molNaI,即2mol碘苯酯2molNaIO3,2mol NaIO3+10I-6molI2,即2mol碘苯酯1molI2 6molI212molI12molNa2S2O3,反应摩尔比为16,98：140. 氧瓶燃烧法中的装置有 A. 磨口硬质玻璃锥形瓶 B. 磨口软质玻璃锥形瓶 C. 铂丝 D. 铁丝 E. 铝丝,96：133（99x：138）选择氧瓶燃烧法所必备的实验物品 A

14、. 磨口硬质玻璃锥形瓶 B. 铂丝 C. 普通滤纸 D. 氢气 E. 无灰滤纸,99：76氧瓶燃烧法测定含氯有机药物时所用的吸收液多数为 A. H2O2溶液 B. H2O2NaOH溶液 C. NaOH溶液 D硫酸肼饱和液 E. NaOH硫酸肼饱和液,99：134. 氧瓶燃烧法可用于 A. 含卤素有机药物的含量测定 B. 醚类药物的含量测定 C. 检查甾体激素类药物中的氟 D. 检查甾体激素类药物中的硒 E. 芳酸类药物的含量测定,二、含金属有机药物的分析,A. 含金属的有机药物 金属原子不与碳原子直接相连，通常为有机酸及酚的金属盐或配位化合物，其分子结构中的金属原子结合不够牢固 如酒石酸锑钾、

15、葡萄糖酸锑钠、富马酸亚铁,酒石酸锑钾 抗血吸虫病药,硬脂酸镁 医药片剂的润滑剂和脱模剂,富马酸亚铁 抗贫血药,葡萄糖酸锑钠 抗寄生虫药，治疗黑热病,B. 有机金属药物 金属原子直接与碳原子以共价键相连，结合比较牢固。在溶液中一般不解离成离子状态。应该根据共价键的牢固程度，经适当处理，将其金属转变为适于分析的状态，方可进行其金属的鉴别或含量测定。 如卡巴胂、醋酸苯汞、汞撒利,卡巴胂 用于阴道滴虫病及丝虫病,醋酸苯汞 外用避孕药,汞撒利 利尿及脱水药，用于心脏性和肝性水肿,含金属有机药物定量分析前的处理方法,不经有机破坏的分析方法 直接测定法;经水解后测定法;经还原-汞齐化后测定法 经有机破坏的分

16、析方法 湿法破坏(硝酸-高氯酸法;硝酸-硫酸法;硫酸-硫酸盐法等);干法破坏；氧瓶燃烧,（一）不经有机破坏的分析方法,1. 直接测定法,适用于金属原子不直接与碳原子相连的含金属有机药物或某些CM键结合不牢固的有机金属药物。 在水溶液中可以电离的药物。,富马酸亚铁的含量测定 ChP (2005),取本品约0.3g，精密称定，加稀硫酸 15ml，加热溶解后，放冷，加新沸过的冷水50ml与邻二氮菲指示液2 滴，立即用硫酸铈滴定液(0.1mol/L)滴定，并将滴定的结果用空白试验校正。每1ml硫酸铈滴定液(0.1mol/L)相当于16.99mg 。,原理,Fe2+ + Ce4+ Ce3+ + Fe2+

17、,2. 用硫酸水解后测定法,例 硬脂酸镁的测定 ChP（2005）,取本品约0.1g，精密称定，精密加硫酸滴定液(0.05mol/L) 50ml，煮沸至油滴澄清，继续加热10min，放冷至室温，加甲基橙指示液12滴，用氢氧化钠滴定液(0.1mol/L)滴定。每1ml硫酸滴定液(0.05mol/L)相当于2.016mg的MgO。,原理：,某些含汞有机药物，由于CHg键不牢固，在水溶液（冰浴）中滴加硫酸使其水解，将有机汞定量转化成硫酸汞，再用硫氰酸铵滴定液滴定。,例 汞撒利的测定,取本品约0.5g，精密称定，加蒸馏水10ml，置冰浴中，滴加硫酸10ml，随滴随搅拌，至产生的沉淀复溶解，再加蒸馏水5

18、0ml，硫酸铁铵指示液2ml，用硫氰酸铵滴定液(0.1mol/L)滴定。每1ml硫氰酸铵滴定液(0.1mol/L)相当于25.29mg的汞撒利。,3. 经还原-汞齐化后测定法,本法系在酸性或碱性溶液中，加锌粉、加热回流，将药物中有机结合的汞还原析出金属汞，并与过量的锌生成锌汞齐。将锌汞齐溶于硝酸后，选用适当的方法测定汞的含量，并换算成含汞有机药物的含量。,如 醋酸苯汞的含量测定 取本品约0.5g，精密称定，置100ml烧瓶中，加水15ml，甲酸5ml与锌粉1g，附回流冷凝器，煮沸30min。放冷，滤过，滤纸和锌汞齐用蒸馏水洗涤至洗液对石蕊试纸不显酸性反应。将锌汞齐溶解在稀硝酸(12)40ml中

19、，置蒸气浴上加热3min，加尿素0.5g和足够的高锰酸钾试液至显桃红色。冷却后，加过氧化氢溶液脱色，加硫酸铁铵指示剂lml，用硫氰酸铵滴定液(0.1mol/L)滴定，即得。每1ml硫氰酸铵液(0.1mol/1)相当于16.84mg的C8H8O2Hg。,4.利用药物中可游离的金属离子的氧化性测定含量 例如含锑和含铁的药物，在酸性溶液中可游离出具有氧化性的Sb5+ 、Fe3+氧化碘化钾析出碘，用硫代硫酸钠滴定。（间接碘量法）。,例 葡萄糖酸锑钠的测定 ChP（2005） 取本品约0.3g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加水100ml、盐酸15ml与碘化钾试液10ml，密塞、振摇后，在暗处静置10min

20、，用硫代硫酸钠滴定液(0.1mol/L)滴定，至近终点时，加淀粉指示液，继续滴定至蓝色消失，并将滴定的结果用空白试验校正。每lml的硫代硫酸钠滴定液(0.1mol/L)相当于6.088mg的Sb。,例 枸橼酸铁铵的测定 ChP（2005） 取本品约0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中。加水15ml溶解后，加硫酸lml，加热至溶液由暗棕色变成淡黄色，放冷至约15，滴加高锰酸钾试液至溶液显粉红色并持续5s，加盐酸15ml与碘化钾试液15ml，密塞，静置3min，加水50ml稀释后，用硫代硫酸钠滴定液(0.1mol/L)滴定至近终点时，加淀粉指示液2ml，继续滴定至蓝色消失，并将滴定的结果用空白试验校

21、正。每lml的硫代硫酸钠滴定液(0.1mol/L)相当于5.585mg的Fe。,（二）经有机破坏的分析方法,适用于金属原子与碳原子结合牢固的有机金属药物。 一般包括湿法破坏、干法破坏及氧瓶燃烧法三种方法。,（1）硝酸-高氯酸 消解,消煮时HNO3具有强的氧化力，热的浓HClO4是最强的氧化剂和脱水剂，能将组分氧化成高价态。加热时生成无水HClO4，可进一步与有机质作用，使有机物很快被氧化分解成简单的可溶性化合物，二氧化硅则脱水沉淀。,HNO3-HClO4消解样品是破坏有机物比较有效的方法，但要严格按照操作程序，防止发生爆炸。,1. 湿法破坏,本法适用于血、尿、组织等生物样品的破坏，有机金属药物

22、经破坏后，得到的无机金属离子一般呈高价态。 本法不能用于含氮杂环药物的破坏。此时宜选用干法灼烧进行破坏。 本法破坏能力强，反应比较激烈。故进行破坏时，必须严密注意切勿将容器中的内容物蒸干，以免发生爆炸。,（2）硝酸-硫酸 消解,两种酸都有较强的氧化能力，其中HNO3沸点低，而H2SO4沸点高（338）； 热的浓H2SO4具有强的脱水能力和氧化能力，可以比较快地分解试样，破坏有机物； 二者结合使用，可提高消解温度和消解效果。,硝酸-硫酸 消解,常用的HNO3与H2SO4的比例为5:2，消解时，先将HNO3加入样品中，加热蒸发至小体积，稍冷，再加入H2SO4、HNO3，继续加热蒸发至冒大量白烟，冷

23、却，加适量水，温热溶解可溶盐，若有沉淀应过滤。为提高消解效果，常加入少量H2O2。,硝酸-硫酸法适用于大多数有机物质的破坏，如染料、中间体或药物等。破坏得到的无机金属离子均为高价态。 本法不能用于含碱土金属有机药物的破坏 因碱土金属可与硫酸形成不溶性的硫酸盐，将会吸附被测定的金属离子，使测定的结果偏低。 改用硝酸一高氯酸法,（3） 硫酸-硫酸盐法 加入浓硫酸作氧化剂 加入硫酸盐（硫酸钾或硫酸钠，因硫酸钠为含水化合物，不利于有机破坏，故一般多采用硫酸钾） 加入硫酸盐目的： 提高硫酸的沸点，增强硫酸的氧化破坏能力，以使样品破坏完全。 防止硫酸在加热过程中过早地分解为三氧化硫而损失。 本法常用于含砷

24、或锑有机药物的破坏，破坏得到的无机金属离子多为低价态。,（4）硫酸-磷酸 消解,两种酸的沸点都比较高，其中H2SO4氧化性较强，H3PO4能与一些金属离子如Fe3+等络合，故二者结合消解样品，有利于测定时消除Fe3+等离子的干扰。,（5） 其它湿法 硝酸硫酸高氯酸法 硫酸氧化剂法（过氧化氢法、高锰酸钾） 破坏后，金属呈高价态,该方法常用于测定汞的样品。KMnO4是强氧化剂，在中性、碱性、酸性条件下都可以氧化有机物，其氧化产物多为草酸根，但在酸性介质中还可继续氧化。,硫酸-高锰酸钾 消解,用浓H2SO4-H2O2氧化剂消煮植物样品时，其中的有机物经脱水碳化、氧化分解，变成CO2和水，使有机氮和磷

25、转化为铵盐和磷酸盐，可在同一份消煮液中分别测定全氮、磷、钾。,总氮、总磷、总钾的测定，样品的消化均采用H2SO4-H2O2消解法进行消解。,硫酸-过氧化氢 消解,多元 消解法,为提高消解效果，在某些情况下需要采用三元以上酸或氧化剂消解体系，混合溶剂具有更强的溶解能力，应用广泛。,目的及前提,多元 消解法,硝酸-硫酸-五氧化二矾消解法,硝酸-氢氟酸-高氯酸消解法,硝酸-硫酸-高锰酸钾消解法,盐酸-硝酸-氢氟酸-高氯酸消解法,硝酸-硫酸-高氯酸消解法,注意事项： 1.湿法破坏所用的仪器，一般为硅玻璃或硼玻璃制成的凯氏烧瓶； 2.所用试剂及蒸馏水均不应含有被测金属离子或干扰测定的其他金属离子等组分；

26、 3.由于整个操作过程所用矿酸量数倍于样品，所以必须按相同条件进行空白试验校正； 4.操作时应在通风橱内进行。,样品的取用量，应视被测含金属有机药物中所含金属元素的量和破坏后所用测定方法而定。 含金属元素量在10g一100g范围内时，取样量为10g; 如果测定方法灵敏度较高，取样量可相应减少。 对于生物样品，一般血样10ml一15ml或尿样50ml,2. 干法破坏,将有机物灼烧灰化以达分解的目的。 将适量样品置于瓷、镍、铂坩埚中，常加无水碳酸钠或轻质氧化镁等以助灰化， 混合均匀后，先小火加热，使样品完全炭化， 然后放入高温炉中灼烧，使其灰化完全，即可。,适用于湿法不易破坏完全的有机物（如含氮杂

27、环类有机药物）以及某些不能用硫酸进行破坏的有机药物。 不适用于含易挥发性金属（如汞、砷等）有机药物的破坏,注意事项： （1）加热或灼烧时，应控制温度在420以下 （2）一定要灰化完全 （3）经本法破坏后，所得灰分往往不易溶解，但不要轻易弃去,4.3 药品质量标准分析方法验证,一、目的,证明所采用的分析方法适合于相应的检测要求，方法验证过程和结果均应记载在药品标准起草和修订说明中。,二、用途,（一）药品质量标准起草时，分析方法需经验证。,（二）药物合成方法变更、制剂的组分变更、原分析方法进行修订时，分析方法需经验证。,三、需验证的分析项目,1. 鉴别试验； 2. 杂质定量或限度检查； 3. 原料

28、或制剂中有效成分含量测定； 4. 制剂中其它成分（降解产物、防腐剂等）的 测定； 5. 溶出度、释放度等功能检查中的溶出量等的测试方法。,准确度 精密度（重复性、中间精密度和重现性） 专属性 检测限 定量限 线性 范围 耐用性,四、验证内容,（一） 准确度（accuracy） 准确度是指用该方法测定的结果与真实值或参考值接近的程度。 测定结果与真实性的差异 用回收率R（recovery）表示 接近100% 相对恒定,测定回收率的具体方法可采用“回收试验法”和“加样回收试验法”。,回收试验 空白+已知量A的对照品（或标准品）测定，测定值为M,加样回收试验 已准确测定药物含量P的真实样品+已知量A

29、的对照品（或标准品）测定，测定值为M,数据要求 规定的范围内，至少用9次测定结果评价，如制备三个不同浓度样品各测三次。 RSD一般在2%以内。,1. 含量测定方法的准确度,原料药可用已知纯度的对照品或样品进行测定，或用本法所得结果与已建立准确度的另一方法测定的结果进行比较。,制剂可用含己知量被测物的各组分混合物进行测定，即采用在空白辅料中加入原料药对照品的方法。 如不能得到制剂的全部组分，可向制剂中加入已知量的被测物进行测定，或与另一个已建立准确度的方法比较结果。,中药分析的准确度一般用加样回收试验衡量。中药回收率一般要求在95105%范围内，有些方法操作步骤繁多时，可要求在90110%范围内

30、。,2杂质定量测定的准确度 可向原料药或制剂中加入已知量杂质进行测定。如果不能得到杂质或降解产物，可用本法测定结果与另一成熟的方法进行比较。,（二）精密度（precision） 精密度是指在规定条件下，同一个均匀样品，经多次（n）取样测定所得结果之间的接近程度。 系指每次测定结果与多次测定的平均值的偏离程度 用偏差（d）、标准偏差(SD)、相对标准偏差(RSD)（变异系数，CV）表示。,方法精密度 表示该分析方法的可重复性(reproducibility) 反映分析方法的可操作性，是方法验证的基本要点之一,精 密 度,精 密 度,在不同实验室由不同分析者测定结果的精密度。 (药典分析方法的建立

31、）,第一章,（1） 重现性 (reproducibility),重现性指采用相同方法，在不同实验室用同一试验物质，由不同操作者使用不同设备所得试验结果的一致性。,当分析方法将被法定标准采用时，应进行重现性试验。 如建立药典分析方法时通过协同检验得出重现性结果，协同检验的过程、重现性结果均应记载在起草说明中。,精 密 度,指同一实验室,不同的时间由不同分析者或使用不同的仪器进行测定的结果的精密度。,第一章,同一实验室，不同时间由不同分析人员用不同设备所得结果的精密度。 考察随机变动因素的影响。 变动因素为不同日期、不同分析人员、不同设备,精密度,重复性指采用相同方法，在同一实验室用同一试验物质，

32、同一操作者使用同一设备，在短时间间隔内，在相互独立试验中所获得结果的一致性。,第四章,在相同条件,由一个分析者测定所得结果的精密度。,在规定的范围内，至少用9次测定结果评价，如制备三个不同浓度样品各测三次或把被测物浓度当作100%，至少测6次进行评价。,精密度,以标准差SD或相对标准差RSD表示。,第四章,表示方法,绝对偏差 相对偏差 d r = 100% = 平均值,精 密 度,偏差 系指测得的结果与平均值之差。 绝对偏差 d i = 测得值平均值 =x i - x （i=1，2，n）,=,=,%,平均偏差,绝对偏差：单项测定与平均值的差值,平均偏差:指单项测定值与平均值的偏差（取绝对值）之

33、和，除以测定次数。平均偏差是代表一组测量值中任意数值的偏差。所以平均偏差不计正负。,例1：计算下面这一组测量值的平均值（ ），平均偏差（d平均），相对偏差（d平均 ） 55.51, 55.50, 55.46, 55.49, 55.51,解：平均值 =xi/n,平均偏差=di/n=xi- /n,=(55.51+55.50+55.46+55.49+55.51)/5 =55.49,=(0.02+0.01+0.03+0.00+0.02)/5=0.016 平均相对偏差= di/n 100% =0.016/55.49100% =0.028 ,表示方法,精密度一般用标准偏差(standard deviati

34、on，SD或)或相对标准偏差(relative standard deviation，RSD)表示 若设供试品的测定值为Xi，则其平均值为 ，且有n个测定值， SD=,RSD= =,包括批内(within-run或intra-assay)RSD日内(within-day) 和批间(between-run或inter-assay)RSD日间(between -day，day-to-day),标准偏差 是反映一组供试品测定值的离散的统计指标。,SX =,=,=,=,=,=,？,2. 测定法分别测定法(),照准确度项下方法，取空白生物基质(如血浆)数份，分别在同一批内和不同批间制备高、中、低 3个浓

35、度的QC样品，并分析测定。 批内RSD 每一浓度56个样品，每个样品测定1次，用随行标准曲线分别计算3个浓度及每1浓度的RSD 批间RSD 每1分析批内每一浓度制备1个样品，每个样品测定1次；用随行标准曲线计算3个浓度(每一浓度56个分析批数据)的RSD,2. 测定法连续测定法(),若实际样品测定所用的分析批次少于5批，也可进行3个批次的连续分析(每1浓度的每1批次为56个样本)方差分析法 批间RSD = 批内RSD = =,第四章 分析方法的建立与验证 第三节 分析方法的验证与要求,例2 用ELISA（酶联免疫吸附测定）法检测vero-E6，细胞培养上清正常标本10份的结果（100 OD49

36、0值）为2，3，3，4，4，5，5，5，6，8，求标准差。,解：先计算 Xi=2+3+3+6+8=45 Xi2=22+32+32+62+82=229,精密度和准确度的关系,准确度和精密度是两个不同的概念，但它们之间有一定的关系。 应当指出的是，测定的精密度高，测定结果也越接近真实值。 但不能绝对认为精密度高，准确度也高，因为系统误差的存在并不影响测定的精密度，相反，如果没有较好的精密度，就很少可能获得较高的准确度。,（1）精密度是保证准确度的先决条件。 （2）高精密度不一定保证高准确度。,精密度高 准确度较差， 即系统误差较大；,甲,乙,丙,准确度高， 但精密度较差， 即偶然误差较大；,精密度

37、比较好 准确度比较好， 称为精确度高， 偶然误差比较小 系统误差比较小,用打靶时弹着点为例，说明上述二个词的意义。用靶心表示其值位置，星点为每次测得值的位置,偏差（d）：测量值与平均值之差,标准（偏）差（SD或S）,相对标准（偏）差（RSD），也称变异系数（CV）,（三） 检测限（limit of detection， LOD） 检测限系指试样中被测物能被检测出的最低量。是限度试验参数，无需定量测定。常用%、ppm、ppb表示。,1非仪器分析目视法 用已知浓度的被测物，试验出能被可靠地检测出的最低浓度或量。,2信噪比法 用于能显示基线噪音的分析方法（仪器分析方法），是把已知低浓度试样测出的信号

38、与空白样品测出的信号进行比较，算出能被可靠地检测出的最低浓度或量。一般以信噪比（S/N）31或21时的相应浓度或注入仪器的量确定检测限。,3数据要求 应附测试图谱，说明测试过程和检测限结果。,（四）定量限（1imit of quantitation，LOQ） 指样品中被测物能被定量测定的最低量，结果应具有一定准确度和精密度。常用%、ppm、ppb表示。,常用信噪比法确定定量限，一般以信噪比（S/N）为101时相应的浓度或注入仪器的量进行确定，也可用仪器所测空白背景响应标准差（SD）的10倍为估计值，再经试验确定。,（五）专属性（specificity） 指有其他成分（杂质、降解物、辅料等）可能

39、存在情况下采用的方法能准确测定出被测物的特性，能反映该方法在有共存物时对供试物准确而专属的测定能力。是指该法用于复杂样品分析时相互干扰程度的度量。,能准确并专一测出被测物的能力。是在分析复杂样品混合物时衡量其是否受到干扰及其程度的一种方法。,专 属 性,药物分析中考虑:杂质、降解产物、相关物质、制剂辅料。,生物药物分析中考虑:内源性物质干扰,代谢产物的干扰,同时服药时的干扰。,（六） 线性(linearity) 在设计的范围内，测试结果与试样中被测物浓度直接呈正比关系的程度。 数据要求：应列出回归方程、相关系数和线性图。,指在一定的浓度范围内,测试结果与供试物浓度呈正比关系的程度。,线 性,第

40、一章,方法 用作图法或计算回归方程建立。 Y=ax+b r=0.999,浓度 应包括一定梯度的5-8个浓度。对于含量测定要求浓度上限为样品最高浓度的120%,下限为样品最低浓度的80%,但应高于LOQ。,（七）范围 指达到一定精密度、准确度和线性的条件下，测试方法适用的高低限浓度或量的区间。,（八） 耐用性 (robusness) 指测定条件稍有变动时，结果不受影响的承受程度，为常规检验提供依据。是衡量实验室和工作人员之间在正常情况下实验结果重现性的尺度。,目的 为常规检验提供依据. 体现耐用性因素： 被测溶液的稳定性 样品提取次数 时间 试剂来源,耐 用 性,指在测定条件有小的变动时,分析相

41、同样品所测得的试验结果的重现程度.,2. 杂质的限量检查除专属性、检测限、耐用性外，其它都不要求。杂质的定量测定除检测限外，其它都要求。,3. 含量测定及溶出量测定除检测限、定量限外，其它都要求。,（九）应用 1. 鉴别试验除专属性、耐用性外，其它都不要求。,不同分析方法对验证参数的要求,（十）各种含量测定方法对效能指标的要求 1. 容量分析法： 用原料药精制品(含量99.5)或对照品考察方法的精密度，相对标准差一般应不大于0.2； 进行回收率试验。回收率一般在99.7100.3之间。,2. UV法： 用适当浓度的精制品进行测定，其RSD一般不大于1。制剂的测定，回收率一般应在98102之间。,线性：吸光度A一般在0.20.7，浓度点n5。用浓度c对A作线性回归处理，得一直线方程，r应大于0.999(n5)，方程的截距应近于零。,3. HPLC法： 要求RSD2，回收率98102之间。 线性范围：用精制品配制一系列