LOX活性测定法.ppt

1、赖氨酰氧化酶活性测定,报告人:马佰菁,赖氨酰氧化酶简介,赖氨酰氧化酶(lysyl oxidase,LOX) 是一种胺氧化酶，LOX作用于细胞外基质(extracellular matrix, ECM)的胶原和弹性纤维，可以催化胶原及在弹性纤维上的赖氨酸残基中的肽酰赖氨酸和羟基赖氨酸发生氧化脱氨基反应，形成肽基醛。醛基的形成导致了自发的凝聚，从而形成分子间及链内的交连，在胶原和弹性蛋白可溶性单体转变为不溶性纤维过程的初始阶段发挥作用，即最终形成胶原与弹性纤维间的共价交连。这对维持细胞外基质的结构和功能正常、组织器官发育、创伤修复、细胞运动等都具有重要意义 。,Amplex Red hydroge

2、n peroxide assay kit 简介 （A 22188，购自Molecular Probes ）,Amplex Red 试剂 (10-acetyl-3,7-dihydroxyphenoxazine)主要是测定过氧化氢和过氧化物的，是一种比色测定。 Amplex Red 结合辣根过氧化物（HRP）后，可检测从细胞、酶联反应过程中产生的过氧化氢，灵敏度很高。,试剂盒组成,1、Amplex Red reagent (MW = 257， Component A，蓝盖 ),五管, 每管 154 g试剂； 2、DMSO（二甲基亚砜，Component B，绿盖), 700 L； 3、5 反应缓冲

3、液 (Component C, 白盖), 28 mL 0.25 M 磷酸盐缓冲液, pH 7.4； 4、Horseradish peroxidase (辣根过氧化物，Component D, 黄盖), 10 U； 5、Hydrogen peroxide (H2O2) (过氧化氢，MW = 34, Component E, 红盖), 200 L 3%的稳定的溶液； 注：储存在-20冰箱，避光。使用前室温融化。一旦打开Amplex Red reagent 应尽快使用。,试剂的配置,1、 配置 10 mM Amplex Red reagent 储备溶液：一管Amplex red（蓝盖）和DMSO（绿

4、盖）室温下化冻，然后60 LDMSO加入管中。使用前配置。 2、配置1反应缓冲液：4ml 5 (白盖)缓冲液加入16ml ddH2O中。（使用前可计算好用量后，再配置。） 3、配置10U/ml辣根过氧化物储存液：用1.0ml 1反应缓冲液溶解试剂（黄盖），然后分装，不用的存-20 冰箱。 4、配置20 mM H2O2稀释标准溶液：用合适体积的1反应缓冲液稀释3%（0.88M）的H2O2，例如20mM H2O2配置可以按22.7L 3%（0.88M）的H2O2加入977L的1反应缓冲液。实际梯度如表上所标：稀释的H2O2稳定性不好，要尽快使用。 5、配置反应混合液：按照50L（1）：100L（3

5、）：4.85ml（2）配置所需要的反应混合液。（反应液的浓度比反应的终浓度小两倍。） 6、500M BAPN的配置：0.128g加入双蒸水1ml。,Figure 2. Detection of H2O2using the Amplex Red Hydrogen Perox-ide/Peroxidase Assay Kit. Reactions containing 50 M Amplex Redreagent, 0.1 U/mL HRP and the indicated amount of H2O2 in 50 Mm sodium phosphate buffer, pH 7.4, were

6、 incubated for 30 minutes at room temperature. Fluorescence was then measured with a fluorescence microplate reader（荧光全自动定量绘图酶标仪。） using excitation at 530 12.5 nm and fluorescence detection at 590 17.5 nm. Background fluorescence (24arbitrary units), determined for a no-H2O2 control reaction, has be

7、ensubtracted from each value. The inset shows the sensitivity of the assay at very low levels of H2O2 .,试剂盒测定LOX酶活性的原理,赖氨酰氧化酶可以和单胺和二胺发生氧化脱氨作用，反应式如下： RCH2NH2 +O2 + H2O =RCHO + NH3 + H2O2。 而H2O 2 和Amplex red 能在型辣根过氧化物酶作为催化剂的条件下, 按11 的摩尔数之比发生氧化反应, 产生荧光物质试卤灵, 反应如下：,试卤灵发出的荧光可以用荧光分光光度仪记录到相应的荧光值, 从而反映培养基中L

8、OX 的浓度。,BAPN是LOX的特异性抑制剂，加入反应体系中是，抑制了LOX的活性，则利用抑制前后荧光值的差值，可以得出LOX的荧光值。根据标准曲线算出LOX的活性。,实验步骤,1、培养细胞（文献3T3细胞）：培养细胞，当细胞的密度达到70%的时候，换用无血清、无酚红的培养液DMEM中，其中含有0.1%的牛血清白蛋白，50 mg/ml磷酸维生素C和10mM b-甘油磷酸酯，培养24H。然后换用新鲜的培养液， 加入或者不加400pM TGF-b1。24小时后，细胞铺满，收集培养液，然后备用用于测定赖氨酰氧化酶活性的测定。(外文献) 种植细胞后的每24h 更换培养基, 培养液成份为高糖DM EM

9、 + 1%双抗(青霉素加链霉素) + 10%新生牛血清+ 1mmo l 磷酸维生素C, 培养27d, 第28d 用无血清和酚酞的DM EM +1mmo l磷酸维生素C 培养24h。（中文献） 2、过氧化氢标准曲线的制备及样品的检测 （试剂盒说明） （1）用1反应缓冲液稀释（4）中的H2O 2，稀释为0-10M，每个体系包括50l，确保要有空白对照。（过氧化氢的浓度比反应终浓度小两倍 0-5M）。如果没有标准曲线可做阴性和阳性对照。阳性对照为用1反应缓冲液稀释（4）中的H2O 2为10M，若阴性对照则用不含H2O 2的1反应缓冲液。,（1）样品的稀释 根据样品中所含H2O2的量用1反应缓冲液稀释

10、样本。最初样本要连续稀释，确定最佳测定量。过高的H2O2含量会有比较低的荧光值。因为过多的H2O2可以和反应产物试卤灵发生反应，变成没有荧光的刃石青。 （2）上样 吸取50l的标准曲线样品液、控制液及样本液与96孔板中，再做一组样本的平行试验，加入500M BAPN。然后每孔中加入（5）中配置好的反应液50l。 （3）孵育与测定 室温避光孵育30min。测定荧光值或吸收值。酶标仪测定530-560nm ，荧光590nm测定发射光或560nm测定吸收光。 （试剂盒说明书） （4）测定细胞中释放的H2O2 （外文文献） 样品的制备，终体积2.0ml，包含1.2M的尿素，0.05M硼酸钠（四硼酸钠，

11、PH8.2），40 ug 辣根过氧化物酶，0.25mg sodium homovanillate ，10mM 1,5-戊二胺，然后37C，孵育30min。平行试验同前。,缓冲液系统适用于用amplex red测定过氧化氢的有：50mM的磷酸钠溶ph7.4（试剂盒货号A-12212，Molecular Probes)）和50mM Tris-HCL,PH7.4。 可是，LOX脱脂肪族胺的氨基的最佳缓冲液是ph8.2磷酸盐液，终浓度包括1.2M尿素，50mM的硼酸盐。 （5）活细胞产生的H2O2的测定（试剂盒） 反应混合物包括50 M Amplex Red reagent and 0.1 U/mL HRP，溶解在KRPG缓冲液中，如果需要活化剂，可以加入PMA，反应体积为100l。每孔加入100l反应混合物，37孵育10min。加入 1.5 104个细胞，这些细胞含在20L KRPG中， 阴性对照加入 20 L KRPG ，测定荧光值。再孵育，选择最理想的。 3、结果 抑制前的荧光值-抑制后的荧光值=LOX荧光值 根据标准曲线上的荧光值查出对应的LOX的浓度，算出LOX的酶活性。,4、讨论 （1） 1,5