通过CreloxP重组酶系统对四膜虫基因N端进行表位附加的构建.ppt

1、通过Cre/loxP重组酶系统对四膜虫基因N端进行表位附加的构建文献选自：Busch et al BMC Microbiology 2010, 10:191,制作人：凌发忠 学号：D201002034,contents,一. 背景知识 二. 内容介绍 三. 结论,一. 背景知识,表位附加标记(epitope tag) ,就是将附加的抗原表位融合到目的蛋白以检测目的蛋白的表达 ,同时还可以通过亲和层析法来纯化目的蛋白及利用免疫荧光技术对标记蛋白进行亚细胞定位。 本文使用表位附加标记是HA和EGFP。 HA 标记一般由 9 个氨基酸组成 ,它来源于流感病毒的血凝素(hemagglutinin ,H

2、A) ,相对应 HA 的单克隆抗体是 12CA51。 EGFP（增强型绿荧光蛋白）：在原核或真核细胞中表达并受到蓝光或紫外光辐照时就可发出亮绿色荧光。,目前对四膜虫C端蛋白标记技术已经完成，多数情况下蛋白标记位于C端，这样抗药的标记很少会干扰到N端的启动子。但其N端蛋白标记技术仍有研究的需要。作者先前试验中发现有些蛋白在C端标记时出现功能异常或干扰与其他蛋白的相互作用等。 N端蛋白标记考虑的方面： 1.不会干扰启动子的功能 2.不会影响下游基因的正确翻译 3.基因同源重组时N端的表位附加不会丢失 Cre/loxP重组酶系统可以解决上述问题,Cre/loxP重组酶系统,Cre 是来源于 P1 噬

3、菌体 Cre 基因所编码的蛋白, 属于 Int 家族。 它可识别 P1 基因组上由 34bp 核苷酸序列构成的称为 LoxP 的特异靶位点, 并根据 LoxP 的方向性, 可在各种底物( 超螺旋环状型, 松驰型和线型 DNA 分子) 上介导三种不同的重组事件,loxP位点,a. 基因序列的插入( 图 1A) ; b. 同向位点之间序列的缺失 ( 图 1B) ; c. 两个反向位点之间序列颠倒( 图 lC)。,构建的思路,可产生Cre酶的四膜虫,具有LoxP位点且与目的基因连锁的一段基因,二. 内容介绍,1. Cre重组酶定位于四膜虫的大核中 2. Cre重组酶的表达抑制了四膜虫的生长 3. C

4、re重组酶可以在LoxP位点上发生精确重组 4. Cre/loxP系统可以用于N端的表位附加,1. Cre重组酶定位于四膜虫的大核中,为了检测Cre重组酶是否能在四膜虫中表达。作者构建了一种质粒pMNMM3（含可取代內源MTT1基因）并在Cd2+离子诱导下其內源启动子能够表达。 同时在cre1基因前加上HA-tag,从而组成PMNMM3-HA-cre1质粒。以此来于野生型四膜虫B2086系进行同源重组。 重组子可以用是否具有抗paromomycin(巴龙霉素，与新霉素neo相似）进行筛选。,插入HA-cre1基因,从E图中可以发现在Cre556（一类含HA-cre1基因表达的四膜虫群体）大部分

5、的內源MTT1基因被HA-cre1表达结构取代。在Cre556系中HA-cre1基因能否表达是接下来需要做的工作。,已知HA-Cre1蛋白分子量为39.7kDa。通过western blotting中利用anti-HA antibody,如图显示CRE556系可以在Cd2+诱导下表达。 要注意的是CRE556系在饥饿状态下HA-Cre1蛋白的表达明显少于养分充足的时候。,免疫荧光检验结果发现HA-Cre1蛋白或HA-Cre1 mRNA可以在结合生殖中从CRE556细胞进入与之结合的另一个细胞。 这样CRE556系可以被用来诱导与之结合细胞的LoxP位点上进行重组。,2. Cre重组酶的表达抑制

6、了四膜虫的生长,CRE556系中发现cre基因的表达对四膜虫具有毒性。 可能Cre酶是一种核酶的原因，而不是由于MTT1基因被HA-cre1基因取代导致的。,结论：HA-Cre1p对四膜虫的生长是消极的，有毒性的。因此，在诱导Cre酶表达时，要考虑尽量减少它的毒性。,3. Cre重组酶在LoxP位点上发生精确重组,为了检测Cre重组酶是否能在两个LoxP位点发生重组，Clara Jana等设计了一个内含loxP-neo4-loxP-EGFP-TWI1的野生型重组子。并使之与CRE556系结合，检测neo4基因能否被移除。,从PCR检测结果可以肯定的是通过Cre重组酶在两个LoxP位点上精确移除neo4基因是可行的。,4. Cre/loxP系统用于N端的表位附加,在loxP-neo4-loxP-EGFP-TWI1基因中，loxP-neo4-loxP序列插在EGFP-TWI1第一个密码子(蛋氨酸）中，因此倘若neo4被HA-Cre1蛋白剔除，则LoxP-EGFP-TWI1序列在內源TWI1启动子得以表达。,三. 结论,综上所述，C