有机溶剂残留量的测定2015

1、药物中有机溶剂残留量的测定,残留溶剂（residual solvent）,定义：药物中的残留溶剂系指在原料药或辅料的生产过程中，以及在制剂制备过程中使用或产生的，但在工艺过程中未能完全去除的有机溶剂。（organic volatile impurities） 研究的性质：杂质研究的范畴,国内外主要相关指导原则和文件 ich q3c 杂质：残留溶剂的指导原则 fda：guidence for industry:q3c impurities:residual solvents emea:position paper on specification fro class 1 and class 2

2、residual solvents in active substances 化学药物有机溶剂残留量研究技术指导原则,国内研究现状：越来越重视，但仍存在很多不规范之处 原因 ：时间短、经验少、对本质认识不够，对国际新研究结果跟踪不及时，对已有指导原则内涵领会不深刻 本讲目标：通过分析和总结，明确一些问题，使研究更科学、更规范。,各国药典中残留溶剂测定收载情况,usp35版 chemical tests / residual solvents 185 ep7.0版 2.4.24. identification and control of residual solvents chp2010年版附

3、录 p 残留溶剂测定法 以上药典方法是残留溶剂研究的重要参考依据,ich 指导原则,人用药品注册技术要求国际协调会议 ( international conference of harmonizition ich ) ich 将药品生产及纯化过程中常用的69 种有 机溶剂按照对人体和环境的危害程度分为4 类。,残留溶剂分类,第1 类溶剂:指已知可以致癌并被强烈怀疑对人和环境有害的溶剂, 其残留量必须控制在规定的范围内; 第2 类溶剂:指无基因毒性但有动物致癌性的溶剂; 第3 类溶剂:指对人体低毒的溶剂。在无需论证的情况下, 残留溶剂的量不高于0.5% 是可接受的, 但高于此值则须证明其合理性;

4、 第4 类:尚无足够毒理学资料的溶剂。,有机溶剂的分类,限度的制定,残留量表示方法：浓度限度 计算公式： 浓度限度（%）pde/(1000剂量) 100% 其中：pde：mg/天 剂量：一般为10g/天,质量标准的制订和修订,pde、浓度限度的比较 pde值：绝对值，控制精确，但可能忽略多种溶剂的综合影响。 浓度限度：以pde为基础，并采用比较大的每天给药量计算，给出了一个比较大的安全系数。 目前情况下，采用浓度限度比较简便，而且只要日摄入总量不超过10g，就无需进一步计算。,药物中有机溶剂的引入,研究对象：原料药/辅料、制剂 原料药/辅料：合成过程中引入 包括： 作为合成原料或反应溶剂引入

5、作为反应副产物引入 由其他合成原料或其他溶剂带入 制剂 各种成份（原料药、辅料）带入 制剂制备过程中引入 制剂制备过程中引入（缓、控释微丸包衣过程使用 有机溶剂；难溶性药物固体分散 ）他克莫司溶于无水乙醇和二氯甲烷中分散。,药物中有机溶剂的引入,研究集中在：原料药的第一种情况 影响因素： 有机溶剂在合成过程中使用的步骤 后续溶剂的影响 中间体的影响 其他（如副反应等） 有机溶剂的使用和残留与合成工艺密不可分，是评价合成工艺优劣，筛选、确定合成工艺的重要因素之一。,药物中有机溶剂的引入,第一类溶剂 原则：考虑其毒性，建议尽量避免使用。,当合成路线涉及此类溶剂时,合成化学发展水平,判断使用是否合理

6、,合理,不合理,严格控制残留量,替代研究,临床研究前,临床研究期间,产品上市后,确定何种溶剂需进行研究的原则,意义和目的 保障临床用药安全，控制产品质量 与其他方面研究工作密不可分 进一步验证工艺控制的合理性 为确定合理可行的质量标准提供数据支持 思考的出发点 有机溶剂的毒性 产品的合成工艺,确定何种溶剂需进行研究的原则,emea 第一类溶剂：不宜使用。一旦作为起始原料、溶剂，或者反应副产物，或者由其他溶剂带入时，残留量需符合ich相关规定。 残留量控制方法：随引入情况不同而不同 直接控制终端产品 控制中间体 控制引入第一类溶剂的物质,确定何种溶剂需进行研究的原则,emea 第二类溶剂：可直接

7、对终产品进行控制，可对中间体进行控制，结果需符合ich相关规定 当6批试生产规模或者3批生产规模的中间体检测结果显示残留量低于ich规定限度的十分之一时，可不对终产品进行控制。,确定何种溶剂需进行研究的原则,研究原则： 考虑到各类有机溶剂有毒性和在终产品中残留的可能性，建议： 第一类溶剂：无论任何步骤使用，均需进行检测 第二类溶剂：无论任何步骤使用，均需进行检测 第三类溶剂：建议可仅对用于终产品精制的此类溶剂进行研究。,确定何种溶剂需进行研究的原则,研究原则： 第四类溶剂 若结构与毒性大的溶剂非常接近，建议尽量不使用 注意中间体的处理，尽量除尽 根据结构和理化性质，参考其他的有机溶剂的检测方法

8、进行检测和控制 注意检测图谱中未知峰的情况，尽量进行归属，若无法归属，可以控制挥发性杂质总量。,若国家标准中未控制残留溶剂，建议根据起始原料的制备工艺，对可能存在的残留溶剂一并在终产品中进行控制。,如果采用尚未批准的原料药、化工中间体等作为起始原料，建议根据起始原料的制备工艺，对可能存在的残留溶剂一并在终产品中进行控制。,9质量标准建立,附录中无限度规定和未收载的有机溶剂: 如在药物的制备过程中使用到了这类溶剂， 建议药物研发者尽量检索有关的毒性等研 究资料，关注其对临床用药安全性和药物 质量的影响。,表1 药品中常见的残留溶剂及限度,第一类溶剂（应该避免使用） 溶剂名称 英文名 限度（ppm

9、) 苯 benzene 2 四氯化碳carbon tetrachloride4 1，2二氯乙烷1,2-dicloroethane 5 1，1-二氯乙烯1,1-dichloroethene 8 1，1，1三氯乙烷 1,1,1-trichloroethane 1500,第二类溶剂（应该限制使用）,溶剂名称英文名浓度限度（ppm) 乙腈acetonitrile410 氯苯chlorobenzene360 氯仿chloroform60 环己烷cyclohexane3880 1，2二氯乙烯1,2-dichloroethene1870 二氯甲烷dichloromethane600 1，2二甲氧基乙烷1,2

10、-dimethoxyethane 100,第二类溶剂（应该限制使用）,n,n-二甲氧基乙酰胺n,n-dimethylacetamide1090 n,n-二甲氧基甲酰胺n,n-dimethylformamide880 1，4二氧六环1,4-dioxane380 2乙氧基乙醇2-ethoxyethanol160 乙二醇ethyleneglycol62 甲酰胺formamide220 正己烷hexane290 甲醇methanol3000 2甲氧基乙醇2-methoxyethanol50 甲基丁基酮methylbutyl ketone50 甲基环己烷methylcyclohexane1180,第二类

11、溶剂（应该限制使用）,n-甲基吡咯烷酮n-methylpyrrolidone4840 硝基甲烷nitromethane50 吡啶pyridine200 四氢噻砜sulfolane160 四氢化萘tetralin100 四氢呋喃tetrahydrofuran720 甲苯toluene890 1，1，2三氯乙烯1,1,2-trichloroethene80 二甲苯xylene2170 通常含有60间二甲苯，14对二甲苯，9邻二甲苯和17乙苯,第三类溶剂（gmp或其它质控要求限制使用）,溶剂名称英文名浓度限度（ppm) 乙酸acetic acid5000 丙酮acetone5000 甲氧基苯anis

12、ole5000 正丁醇1-butanol5000 仲丁醇2-butanol5000 乙酸丁酯butyl acetate5000 叔丁基甲基醚tert-butylmethyl ether5000 异丙基苯cumene5000 二甲亚砜dimethyl sulfoxide5000 乙醇ethanol5000 乙酸乙酯ethyl acetate5000 乙醚ethyl ether5000 甲酸乙酯ethyl formate5000,第三类溶剂（gmp或其它质控要求限制使用）,甲酸formic acid5000 正庚烷heptane5000 乙酸异丁酯isobutyl acetate5000 乙酸异丙

13、酯isopropyl acetate5000 乙酸甲酯methyl acetate5000 3甲基1丁醇3-methyl-1-butanol5000 丁酮methylethyl ketone5000 甲基异丁基酮methylidobutyl ketone5000 异丁醇2-methyl-1-propanol5000 正戊烷pentane5000 正戊醇1-pentanol5000 正丙醇1-propanol5000 异丙醇2-propanol5000 乙酸丙酯propyl acetate5000,第四类溶剂（尚无足够毒理学资料）,溶剂名称英文名 1，1二乙氧基丙烷1，1diethoxyprop

14、ane 1，1二甲氧基甲烷1,1-dimethoxymethane 2，2二甲氧基丙烷2,2-dimethoxypropane 异辛烷isooctane 异丙醚isopropyl ether 甲基异丙基酮methylisopropyl ketone 甲基四氢呋喃methyltetrahydrofuran 石油醚petroleum ether 三氯乙酸trichloroacetic acid 三氟乙酸trifluoroacetic acid,残留溶剂测定方法,干燥失重：专属性差 gc法(普通)：首选方法 顶空进样法 直接进样法 hplc法：例如测定吡啶 离子色谱法：测定n-甲基吡咯烷酮 气质联用

15、,有机溶剂残留量测定方法分类,1.直接进样法 适用范围：沸点高溶剂或受热不易分解样品。 优点：简便、无需专用设备，绝对进样量大。 缺点：污染进样口及柱子，溶剂峰响应大，样品分解产物或溶剂杂质峰可能影响测定，对溶剂的纯度要求高。,2.顶空进样法（headspace analysis) 2.1 静态顶空技术 2.2 动态顶空技术（吹扫捕集法） 适用范围：沸点低溶剂或样品本身对测定有影响。 优点：在较低温度下进行，避免组分分解；减少溶解 样品的溶剂量和样品本身对色谱系统的干扰和污染，增加色谱柱的寿命。 缺点：需要特定的顶空进样装置，成本较高，对沸点较高的溶剂检测灵敏度不够，一般多应用于沸点100以下

16、的溶剂。,顶空进样法的原理,顶空分析是通过样品基质上方的气体成分来测定这些组分在原样品中的含量。这是一种间接的分析方法，其基本理论是在一定条件下气相和凝聚相（液相或固相）之间存在着分配平衡。所以气相的组成能反映凝聚相的组成。,当样品的蒸气压相当低时，色谱峰面积(ai)与挥发性组分（i）的蒸气压（pi)成正比 ai=cipi ci与物质种类及检测器有关的特定常数。,对于理想混合体系，依据拉乌尔定律： pi=ip0ixi p0i为纯组分（i）的蒸气压，xi为组分（i）的摩尔分数,i组分的活度系数。,服从拉乌尔定律的混合体系，其峰面积与浓度成线性关系。但在高浓度区域内分压的变化与浓度变化不成线性关系

17、，有时甚至与浓度无关。如果不注意这一点，顶空分析会得到错误的结果。 因此分析中定量校正尤为重要。在很多情况下，样品溶液若能充分稀释，则能使其接近理想体系，服从拉乌尔定律。,顶空进样法的特点,、样品不需要前处理，它只取气相部分进行分析，大大减少了样品基质对分析的干扰。 、进样量大，灵敏度高，可用于痕量有机挥发性物质的测定。 、对于易挥发或易分解和无法直接进样分析的液体或固体样品而言，更有它的实用价值。除分析中草药中挥发性成分外，还常用于固体药物、包装材料、药物的残留溶剂分析,顶空分析可以看成是一种气相萃取方法，即用气体作“溶剂”来萃取样品中的挥发性成分，因而顶空分析就是一种理想的样品净化方法。

18、传统的液液萃取及spe都是将样品溶解在液体中，不可避免地会有一些共萃取物干扰分析。,静态顶空分析装置,手动进样装置,采用手动进样时，所需设备简单，只要有一个控温精确的恒温槽和顶空瓶。 将装有样品的顶空瓶置于恒温槽中，在一定的温度下达到平衡后，就可用注射器从容器中抽取顶空气体，注入gc进行分析。,手动进样的的两个缺点,1.压力控制难以实现。 2.温度的控制，注射器的温度低时，某些沸点高的样品组分很容易冷凝。 由于上述原因，手动进样的准确度差，分析重现性难以保证。 在只作定性分析时，手动进样不失为一种经济的方法，要作精确的定量分析最好用自动顶空进样装置。,自动顶空进样装置,自动顶空进样装置,顶空进

19、样器工作原理,影响顶空分析的因素,1.样品的性质 顶空气体中单个组分的含量既与其本身的挥发性有关，又与样品基质有关。特别是那些在样品基质中溶解度大（分配系数大）的组分，“基质效应”更为明显。 标准溶液必须有与原样品相同或相似的基质，否则，定量误差将会很大。,一些消除或减少基质效应的方法,（1）利用盐析作用 在水溶液中加入无机盐（如硫酸钠）来改变挥发性组分的分配系数。但当盐浓度小于5%时几乎没有作用，故常用高浓度的盐，甚至用饱和浓度。盐析作用对极性组分的影响大于非极性组分的影响。此外，在水溶液中加入盐之后，溶液体积会变化，定量线性范围可能变窄。,一些消除或减少基质效应的方法,（2）在有机溶液中加

20、入水，当然，水要与有机溶剂相溶。这可以减少有机物在有机溶剂中的溶解度，增大其在顶空气体的含量。分析灵敏度可增加几倍数百倍。 （3）调节溶液的ph 对于碱和酸，通过控制ph可使其解离度改变，或使其待测物的挥发性变的更大，从而有利于分析。 （4）样品应溶解在合适的溶剂中，一般可用水、dmf、dmso或其混合溶剂作溶媒。,2.样品体积 顶空瓶中的样品体积对分析结果影响很大，因为它直接决定相比。 cg=co/(k+ ) 其中=vg/vl ，k=cl/cg 对于一个给定的气液平衡系统，k和co为常数， 与顶空气体中的浓度成正比。 样品体积vl增大， 减少，cg增大，灵敏度增加。但对于具体的 样品体系，还

21、要看k 的大小。当k 时，样品体积的改变对分析灵敏度影响小。当k时，影响就很大。,顶空分析是只从样品瓶中取样一次，每份样品体积是否重现影响分析结果。 待测组分的分配系数越小（在凝聚相中溶解度越大），样品体积波动所造成的结果误差越大；反之越小。,3.平衡温度 样品的平衡温度与蒸气压直接相关，它影响分配系数。 温度越高，蒸气压越高，顶空气体的浓度越高，分析灵敏度越高。待测组分的沸点越低，对温度越敏感。因此，顶空分析特别适合于分析样品中的低沸点成分。,温度对顶空分析灵敏度的影响,水中溶解性越好,平衡温度越敏感。,4.平衡时间 平衡时间取决于组分分子从样品基质到气相的扩散速度。扩散速度越快，所需时间越

22、短。扩散系数与分子大小、介质黏度及温度有关。温度越高，黏度越低，扩散系数越大。所以，提高温度可以缩短平衡时间。,与样品瓶有关的因素,1.样品瓶 要求体积准确，能承受一定的压力，密封性能好，对样品无吸附。 样品瓶的体积有520ml多种，具体选用那种，要根据仪器及样品情况而定。 顶空瓶若要反复使用，可用洗液浸泡，然后用蒸馏水冲洗，最后置烘箱中烘干。,2.密封垫 密封垫的材料主要有三种：硅橡胶、丁基橡胶、氟橡胶。 硅橡胶垫耐高温、丁基橡胶垫价格低、氟橡胶垫惰性好。 为防止密封垫对样品组分的吸附，现在多用内衬聚四氟乙烯或铝的密封垫。 选用时要看分析条件（温度）和样品具体情况而定。常规分析可用价格低的

23、丁基橡胶垫 ，痕量分析则最好选用有内衬的硅橡垫胶。,顶空分析方法开发的步骤,1 .确定如何处理样品。如待测组分挥发性太低，则可用直接进样测定。考虑用何种溶剂溶解。 2. 根据待测组分确定分析条件-色谱柱、检测器、及操作条件。通过标准样品进样分析来优化分离条件。 3. 确定平衡时间和平衡温度。 4. 样品的分析，主要考察灵敏度是否满足要求。通过改变分流比、顶空取样条件（改变进样时间或定量管）来控制信号的大小。改变平衡温度、相比、消除基质效应以提高分析灵敏度。 5.对测定方法进行方法学验证线性、回收率、精密度、最低检测量,聚苯乙烯（ps）中单体苯乙烯的测定,2-甲氧基乙醇作内标（2）,医疗设备中环

24、氧乙烷（eo）的测定,环氧乙烷（eo）用于医疗设备的消毒，它是一种已知的致癌物质。有关法规要求用顶空法测定经消毒的医疗设备中eo的含量。可用标准加入法测定聚苯乙烯（pvc）和高密度聚乙烯（hdpe）制成的医疗设备经消毒后残留的eo。,顶空分析条件：hp7694自动顶空进样器，平衡温度：100，平衡时间：60min，输送管和连接管温度：105，瓶压：10psi，加压时间0.5min，定量管体积1ml，冲样时间0.15min，进样时间：2.3min。,多点标准加入法,两种方法的原理,方法a和b是正交处理方法。,在两种方法中都有共流出现象，但是方法a中 的共流出峰在方法b中得到了解决，反之亦然。 最

25、终通过方法c进行定量分析。,usp残留量测定介绍,usp:方法a,顶空进样器操作条件,水溶性物质方法a的制备,方法a系统适用性,方法a- 1类溶剂,方法a- 二类溶剂，混合液a,方法a- 二类溶剂，混合液b,方法a- 3类溶剂,方法b,方法b,方法b：系统适用性,方法b1类,方法b-2类,方法b-2类,方法b-3类溶剂,方法c,方法c,与方法a相同再加上：,标准溶液:,在方法a和b中已定性的峰用usp溶剂标准品来稀释,增敏溶液,供试品与标准品的混合液,方法c:系统适用性,1类标准溶液,信噪比s/n: 1,1,1 三氯乙烷5,1类系统适用性溶液,信噪比s/n: 所有的峰3,2类mixture a

26、 standard solution 分离度: 乙腈与二氯甲烷1.0,如果用方法b的话，按照它的系统适用性要求。,计算每个残留溶剂的量,ppm=5(c/w)ru/(rst-ru),c=浓度,ppm,标准溶液的相关美国对照品浓度 w=质量,g,为供试品贮备液中供试品的重量 r=供试品溶液的残留溶剂的峰响应,rst=加入标准溶液供试品溶液的残留溶剂的峰响应,方法c:计算,供试液制备水溶性样品,供试品储备溶液：取250mg供试品，置25ml量瓶中，用水并稀释至刻度。 供试品溶液：取上述储备液5ml，置顶空瓶中，加水1ml，加塞，加盖。,供试液制备非水溶性样品,供试品溶液储备液:转移500mg的待测物

27、质,精确称 取,至一个10ml量瓶,用二甲基甲酰胺稀释至刻 度，混匀。,供试品溶液:转移供试品储备液1.0ml至一合适的 顶空进样瓶中，包含有5.0ml的水，加塞，压盖， 混匀。,标记溶液:转移1.0ml供试品储备液到一合适的顶 空进样瓶中，再加入1ml的标准储备液和4.0ml的 水，加塞，压盖，混匀(制备在方法a和方法b中已 经定性的各峰的增敏溶液),可选的方法,usp-nf总要求: 也可选用别的在准确度、 灵敏度、精密度、选择性或适用性方面有一定 优势的方法，以满足自动化或减少数据处理或 其它特殊的要求。这种方法应该得到验证 当出现不同或争议时，只有按药典方法获得的 结果为决定性结果,us

28、p-nf:general chapter ,usp固定相（26种）,usp固定相,usp固定相,欧洲药典有关残留溶剂的内容,溶剂分类同ich 测定方法为顶空进样法，分a、b两个系统。 下列溶剂不宜用顶空法测定： 甲酰胺（formamide） 2-乙氧基乙醇（2-methylethanol) 四氢噻砜（sulfolane) 2-甲氧基乙醇（2-methoxyethanol) 乙二醇（ethylene glycol) n-甲基吡咯啉（n-methylpyrrolidone),欧洲药典残留量测定样品制备,根据样品的溶解性选择合适的溶剂 水溶性样品用水作溶剂，非水溶性样品用二甲基甲酰胺作溶剂。 测定二

29、甲基甲酰胺或二甲基乙酰胺时用1、3-dimethyl-2-dimethyl-2-imidazolidinone(dmi)作溶剂。 供试液制备： 取0.2g样品，用上述溶剂溶解，稀释至20ml。 测定溶液: 取供试液5.0ml，加1.0ml空白溶剂。,对照溶液的制备,对照储备液：取待测溶剂，溶于适量二甲亚砜中，加水稀释至100ml，取适量用水稀释至一定浓度。 测试用对照溶液：取样品溶液5.0ml，置顶空瓶中，加1.0ml对照储备液，加盖，密封。,欧洲药典残留量测定色谱条件a,色谱柱：30m0.32（0.53）mm1.8（3.0）m 6%氰丙基苯-94二甲基聚硅氧烷（hp-624） 载气：n2 或

30、he 线速度:35cm/s 分流比：5：1 进样口温度：140 检测器温度：250 柱温：40（20min），20 /min升温至240 ，维持20min。 系统要求：乙腈与二氯甲烷的分离度1.0，信噪比：5, rsd15%,欧洲药典残留量测定色谱条件b 色谱柱：30m0.32（0.53）mm0.25m 固定液macrogol 20，000（hp-wax） 载气：n2 或he 线速度:35cm/s 分流比：5：1 进样口温度：140 检测器温度：fid 250 柱温：50（20min），6 /min升温至165 ，维持20min。 系统要求：乙腈与三氯乙烯的分离度1.0，信噪比：5，rsd15

31、%,结果判断,测定溶液色谱峰面积小于对照溶液峰面积的50，结果符合规定。 如需定量测定，可采用标准加入法测定。,中国药典2010年版附录残留量测定方法,药物中常见的残留溶剂及限度见附表1，除另有规定外，第一、第二、第三类溶剂的残留量应符合表中的规定；对其他溶剂，应根据生产工艺的特点，制定相应的限度，使其符合产品规范、gmp或其他基本的质量要求。,色谱柱,毛细管柱 除另有规定外，极性相近的同类色谱柱之间可以互代使用。 （1）非极性色谱柱 固定液为100的二甲基聚硅氧烷的毛细管柱。 （2）极性色谱柱 固定液为聚乙二醇（peg-20m）的毛细管柱。,（3）中极性色谱柱 固定液为（35%）二苯基-（6

32、5%）甲基聚硅氧烷，（50%）二苯基-（50%）二甲基聚硅氧烷， （35%）二苯基-（65%）二甲基聚硅氧烷，（14%）氰丙基苯基-（86%）二甲基聚硅氧烷，（6%）氰丙基苯基-（94%）二甲基聚硅氧烷的毛细管柱。,（4）弱极性色谱柱 固定液为（5%）苯基-（95%）甲基聚硅氧烷，（5%）二苯基-（95%）二甲基聚硅氧烷共聚物的毛细管柱。,2填充柱 以直径为0.250.18mm的乙二烯苯-乙基乙烯苯型高分子多孔小球或其他适宜的填料作为固定相。,系统适用性试验,（1）用待测物的色谱峰计算，毛细管色谱柱的理论板数均应大于5000；填充柱法的理论板数应大于1000。 （2）色谱图中，待测物色谱峰与其

33、相邻的色谱峰的分离度应大于1.5； （3）以内标法测定时，对照品溶液连续进样5次，所得待测物与内标物峰面积之比的相对标准偏差（rsd）应不大于5；若以外标法测定，所得待测物峰面积的相对标准偏差（rsd）应不大于10。,供试品溶液的制备,1顶空进样 除另有规定外，精密称取供试品0.11g；通常以水为溶剂；对于非水溶性药物，可采用n，n二甲基甲酰胺、二甲基亚砜或其他适宜溶剂；根据供试品和待测溶剂的溶解度，选择适宜的溶剂且应不干扰待测溶剂的测定。根据品种正文中残留溶剂的限度规定配制供试品溶液，浓度满足系统定量测定的需要。,2溶液直接进样 精密称取供试品适量，用水或合适的有机溶剂使溶解；根据品种正文中

34、残留溶剂的限度规定配制供试品溶液，其浓度满足系统定量测定的需要。,对照品溶液的制备,精密称取各品种项下规定检查的有机溶剂适量，采用与制备供试品溶液相同的方法和溶剂制备对照品溶液。若为限度实验，根据残留溶剂的限度规定确定对照品溶液的浓度；若为定量测定，为保证定量结果的准确性，应根据供试品中残留溶剂的实际残留量确定对照品溶液的浓度；通常对照品溶液的色谱峰面积与供试品溶液中对应的残留溶剂的色谱峰面积以不超过2倍为宜。必要时，应重新调整供试品溶液和对照品溶液的浓度。,测定法,第一法 毛细管柱顶空进样等温法 当需要检查的有机溶剂数量不多，并极性差异较小时，可采用此法。 色谱条件 柱温一般为40100；常

35、以氮气为载气，流速为每分钟1.02.0ml；顶空瓶加热温度为7085，顶空瓶加热时间3060分钟；进样口温度为200；如采用fid检测器，温度为250。 测定法 取对照品溶液和供试品溶液，分别连续进样不少于2次，测定待测峰的峰面积。,第二法 毛细管柱顶空进样系统程序升温法,当需要检查的有机溶剂数量较多并极性差异较大时，可采用此法。色谱条件 如为非极性色谱系统，柱温一般先在30维持7分钟，再以8/min的速度升至120，维持15分钟；如为极性色谱系统，柱温一般先在60维持6分钟；再以8/min的升温速率升至100，维持20 分钟；以氮气为载气，流速为2.0ml/min；顶空瓶温度7085，顶空时

36、间3060分钟；进样口温度为200；如采用fid检测器，温度为250。,具体到单个药品的残留溶剂检查时，可根据该品种项下的残留溶剂组成调整程序升温速率。 测定法 取对照品溶液和供试品溶液，分别连续进样不少于2次，测定待测峰的峰面积。,第三法 溶液直接进样法,可采用填充柱，亦可采用适宜极性的毛细管柱。 测定法 取对照品溶液和供试品溶液，分别连续进样不少于3次，每次2l，测定待测峰的峰面积。,计算法,（1）限度实验：以内标法测定时，计算单位重量样品中的色谱峰面积与内标峰面积之比；供试品溶液所得的峰面积比的平均值不得大于由对照品溶液所得的峰面积比的平均值。以外标法测定时，供试品溶液所得的单位重量中样

37、品待测物峰的平均面积不得大于由标准溶液所得的待测物峰的平均峰面积。 （2）定量测定：按内标法或外标法计算各残留溶剂的量。,顶空进样法测定应注意问题,a应根据供试品中残留溶剂的沸点选择顶空温度。对沸点较高的残留溶剂，通常选择较高的顶空温度；但此时应兼顾供试品的热分解特性，尽量避免供试品产生的挥发性热分解产物对测定的干扰。,b顶空时间一般为3045分钟，以保证供试品溶液的气-液两相有足够的时间达到平衡。顶空时间通常不宜过长，如超过60分钟，可能引起顶空瓶的气密性变差，导致定量准确性的降低。 c对照品溶液与供试品溶液必须使用相同的顶空条件。,定量方法的验证,当采用顶空色谱系统测定时，供试品与对照品处

38、于不完全相同的基质中，故应考虑气液平衡过程中的基质效应。由于标准加入法可以消除供试品溶液基质与对照品溶液基质不同所致的基质效应的影响，故通常采用标准加入法验证定量方法的准确性。当标准加入法与其他定量方法的结果不一致时，应以标准加入法的结果为准。,干扰峰的排除,供试品中的未知杂质或其挥发性热降解物易对残留溶剂的测定产生干扰。干扰作用包括在测定的色谱系统中未知杂质或其挥发性热降解物与待测物的保留值相同（共出峰）；或热降解产物与待测物的结构相同（如甲氧基热裂解产生甲醇）。,当测定的有机溶剂残留量超出限度，但未能确定供试品中是否有未知杂质或其挥发性热降解物对测定有干扰作用时，应通过试验排除干扰作用的存

39、在。对第一类干扰作用，通常采用在另一种极性相反的色谱柱系统中对相同样品再进行测定，比较不同色谱系统中测定结果的方法。如二者结果一致，则可以排除测定中有共出峰的干扰；如二者结果不一致，则表明测定中有共出峰的干扰。对第二类干扰作用，通常要通过测定已知不含该溶剂的对照样品来加以判断。,含氮碱性化合物的测定,普通气相色谱的不锈钢管路、进样器的衬管等对有机胺等含氮碱性化合物具有较强的吸附作用，致使其检出灵敏度降低。当采用顶空进行系统测定此类化合物时，应采用惰性的硅钢材料或镍钢材料管路；或采用溶液直接进样法测定。供试品溶液应不呈酸性，以免待测物与酸反应后不易气化。,通常采用弱极性的色谱柱或经碱处理过的色谱

40、柱分析含氮碱性化合物，如果采用胺分析专用柱进行分析，效果更好。 对不宜采用气相色谱法测定含氮碱性化合物，如n-甲基吡咯烷酮等可采用其他方法如离子色谱法等测定。,检测器的选择 对含卤素元素的残留溶剂如氯仿等，采用ecd检测器，易得到高的灵敏度。 由于不同的实验室在测定同一药品时可能采用了不同的实验方法，当测定结果处于合格不合格边缘时，以采用内标及标准加入法为准。 甲酰胺、2-甲氧基乙醇、2-乙氧基乙醇、乙二醇、n-甲基吡咯烷酮等不宜用顶空进样方式测定。,原料药中有机溶剂残留量测定,以下简单介绍在新药质量标准研究中开发的一些测定实例。 辛伐他汀原料残留溶剂的检测,对照溶液和供试品溶液的制备,内标溶

41、液的制备：精密量取丁酮适量，加80%dmso溶液稀释制成1ml含80g的溶液。 对照品溶液的制备：取上述溶剂适量，用内标溶液稀释制成每1ml中含甲醇79g、乙醇79g、丙酮79g、乙醚36g、二氯甲烷40g、正己烷13g、四氢呋喃44g、苯0.35g、环己烷38g、甲苯17g的溶液作为对照溶液。,供试品溶液的制备：取样品约0.5g，精密称定，置顶空瓶中，精密加内标溶液5ml，加盖封密，即得。,顶空进样器条件,顶空炉温：80，热平衡时间：30分钟，充样时间：0.2分钟，进样时间：1分钟。,辛伐他汀原料残留溶剂的检测,1.甲醇2.乙醇3.丙酮4.乙醚5.二氯甲烷6.正己烷7.四氢呋喃8.苯9.环己

42、烷10.甲苯,混合对照溶液,四川某公司（y-01-050801）,四川某公司（y01-051101）,浙江某公司（050302）,样品名：替米沙坦 色谱柱：hp-624 柱温：50 分流比：1：1 溶剂：稀硫酸 平衡温度：80,替米沙坦样品测定色谱图,抗爱滋病新药司他夫定（色谱柱：hp-innowax 柱温：45）,司他夫定样品测定色谱图 注意：样品分解产物对测定的影响,样品名：佐米曲普坦 色谱柱：hp-50 柱温：50（10min），15/min至180 （5min） 溶剂：50%dmf 平衡温度：95,佐米曲普坦样品测定色谱图,盐酸阿扎司琼溶剂残留量测定：对照溶液 依次为氯仿、二氯乙烷、甲

43、苯,盐酸阿扎司琼样品溶液：rt4.287min为氯仿,残留溶剂研究基本内容,1、确定被测残留溶剂 2、确定残留溶剂类别 3、限度确立,4、确定测定方法,5、选择色谱柱和检测器,6、制备供试品和对照品溶液 7、测定条件的优化 8、方法学验证,9、质量标准建立 10、其他,1确定被测残留溶剂,一般原则,(1) 工艺中使用二类以上和重结晶用溶剂，及根 据工艺特点要求其它溶剂进行残留量研究。 (2)建议对合成最后三步使用的三类溶剂也进行,研究。,建议原则仔细分析，别落下,(1)申报资料合成工艺中用到所有有机溶剂 (2)液态催化剂等,(3)趋势:胺类和羧酸类,2确定残留溶剂类别,盐酸克林霉素棕榈酸酯举例

44、, 使用溶剂(种):乙醇、丙酮(精制)、二氯甲烷、,三氯甲烷、吡啶与dmf。, 分类:,测定方法确认：考虑dmf沸点较高，吡啶顶空条 件下检测灵敏度较低，故上述两种溶剂采用直接 进测定，其余溶剂采用顶空进样测定。,标准制定：按照ich规定将二类有机溶剂二氯甲 烷、三氯甲烷、吡啶与dmf订入质量标准中，限 度参照ich规定。同时将精制溶剂丙酮列入质量 标准中，限度为不得过0.1%。,4确定定量方法,选择定量方法 外标法 内标法,标准加入法:利用加入该组分前后色谱峰响应 信号的变化而计算被测组分含量的方法 操作:测定供试品,测定供试品对照品 使用:边缘产品以标准加入法结果为准;,顶空方式基质效应。

45、,5选择色谱柱和检测器,色谱柱分类,填充柱和毛细管柱 毛细管柱,wcot或plot,极性大小（按固定液极性分类） 按内径分 液膜厚度,填充柱,大口径毛细管柱,常用毛细管柱,5% ov101,on 80/100 chromosorb,30m 0.53mm 0.88m,30m 0.32mm 0.25m,不同色谱柱类型分离效果的比较,5选择色谱柱和检测器,填充柱和毛细管柱 填充柱, 柱效低，分离复杂样品的能力差。, 以直径为0.250.18mm的乙二烯苯-乙基乙 烯苯型高分子多孔小球或其他适宜的填料作 为固定相。,毛细管柱：柱效高，灵敏度高，分离好。,5选择色谱柱和检测器,选择合适色谱柱,样品与待测

46、溶剂按照相似相溶原理选择色谱 非极性柱:各组分按沸点顺序流出色谱柱，沸 点低者先出。若试样中有极性组分，相同沸点 的极性组分先出峰。,中等极性柱:各组分基本仍按沸点顺序流出色 谱柱，沸点低者先出。但沸点相同极性与非极 性组分，极性组分后出峰。,5选择色谱柱和检测器,毛细管柱按液膜厚度分类,薄膜比厚膜洗脱组分快，峰分离好、温度低，适用 高沸点、组分密集或热敏化合物。,大口径柱保持分离度和保留时间，都只有厚膜。 0.10.2m 薄膜和0.250.5m 标准膜适用高沸 点化合物。,1.01.5m厚膜:测定适合流出温度100200。 35m 超厚膜：分析气体、溶剂和可吹扫出来的 物质。,5选择色谱柱和

47、检测器,选择合适色谱柱,极性柱:各组分按极性顺序流出色谱柱，极性 低者先出。,注意:混合物中组分性质差别，如分离极性与 非极性混合物，一般选用极性柱。分离沸点差 异较大的混合物，一般选用非极性柱。,5选择色谱柱和检测器,选择合适色谱柱,根据经验顺序选择,chp2005中 100的二甲基聚硅氧烷和聚乙二醇 ep db-624和innowax,仪器商手册。如：agilent产品目录提供db-1、 db-624和db-wax的出峰顺序。,检测器,样品类型,灵敏度范围,气体流量 (ml/min.),载气+尾吹气 氢气 空气,fid,碳氢化合物 10-100pg,20-60,30-40 200- 500

48、,tcd,15-30 n.a n.a.,除载气外的 5-100ng 其它所有物质,ecd,有机卤化物 0.05-1pg,30-60,n.a.,n.a.,氯化溶剂 50 ppt-1ppm &农药残留,npd 有机氮化合物&,0.1-10 pg,20-40,1-5,70-100,有机磷化合物,5选择色谱柱和检测器 检测器的选择,6制备供试品和对照品溶液,溶剂选择要求,能同时溶解供试品和待检残留溶剂；当样 品在溶解介质中未完全溶解时，结果通常 偏低且精密度差。,溶剂自身及其杂质不干扰待检残留溶剂的 测定；dmso、dmf,和待检残留溶剂保持相对稳定；,避免使用污染性大、毒性大的溶剂。 水是首选溶剂，

49、特别是顶空进样系统。,6制备供试品和对照品溶液,溶剂的选择,水溶性药物：水,非水溶性药物：不挥发的酸、碱液；dmf或 dmso等，不可使用盐酸液和氨水。 可以单独使用，也可以混合使用,顶空进样可选择在8090加热能溶解样品 的溶剂。,6制备供试品和对照品溶液,样品的制备,不可研磨样品，必须原态取样；,不可超声、不能加热溶解样品（直接进样 法）；,样品置顶空瓶中压盖后可以超声、加热； 测定酯类溶剂时不能采用酸或碱溶液，以 免发生水解 。,6制备供试品和对照品溶液,样品的制备,测定含氮的碱性溶剂时，供试品溶液应不 呈酸性，以免被测物与酸反应不易汽化； 测定含羧基的酸性溶剂时，供试品溶液应 不呈碱性

50、，以免被测物与碱反应不易汽化。 如：测定氟伐他汀钠(ph8.010.0)中乙酸 残留量，不出峰，需对其甲酯化后测定。,6制备供试品和对照品溶液,对照品溶液的制备,对照品溶液：必须与供试品溶液相同溶剂。 苯、甲苯、三氯甲烷等水溶性不好的溶 剂，可先用少量dmf等溶解待查溶剂，再用 水稀释。,2010版新增：采用与制备供试品溶液相同的溶,剂制备对照品溶液。如用水作溶剂，应先将待测 有机溶剂溶解在50二甲亚砜或n,n-二甲基甲酰 胺溶液中，再用水逐步稀释。,6制备供试品和对照品溶液,供试品和对照品溶液浓度确定,根据残留溶剂的限度规定配制供试品溶 液，浓度应能满足系统定量测定的需要 一般供试品取样量为

51、0.11g,限度试验：对照品溶液的浓度可按残留溶 剂规定的限度配置；,定量测定：按实际残留量配置，浓度相差 最好不超过2倍为宜。必要时应重新调整 。,6制备供试品和对照品溶液,顶空进样基质效应,顶空气体中单个组分的含量既与其本身的挥发 性有关，又与样品基质有关。特别是那些在样 品基质中溶解度大（分配系数大）的组分，基 质效应更为明显。,标准溶液必须有与原样品相同或相似的基 质，否则可能导致定量误差将会很大。,标准加入法可以有效地排除基质效应的影响； 当标准加入法结果与内标法结果系统偏差约 10%时，可以认为方法存在明显的基质效应。,6制备供试品和对照品溶液,盐酸克林霉素棕榈酸酯举例, 直接进样

52、(吡啶与dmf):样品在甲醇和乙醇中溶 解性均较好，考虑在极性柱中甲醇出峰较快， 干扰较少，故采用甲醇为溶解样品的溶剂。, 顶空进样:样品在水中溶解性较好，故首选。同 时考虑三氯甲烷在水中溶解性较差，最后采用 5%dmf水溶液作为顶空测定溶解样品溶剂。,7测定条件的优化,顶空条件优化 柱温优化,进样口温度优化 进样衬管 气路优化,7测定条件的优化,顶空条件优化 平衡温度,对沸点较高残留溶剂，必须较高的顶空温度， 兼顾供试品热分解，避免产生挥发性热分解产 物干扰。,溶剂的沸点，一般应比溶解用溶剂沸点低10 以上。在灵敏度能满足的条件下，尽量采用较 低的平衡温度。,7测定条件的优化,顶空条件优化

53、常用平衡温度,水：顶空温度不宜超过85,ep/usp规定为80,顶空温度为100(柱温低于顶空温度)，大量的水被蒸 发,随着水蒸汽的凝结，水中溶解度大溶剂灵敏度明显下 降(如:乙腈),dmso/dmf：顶空温度不宜超过115,ep/usp规定为105。,7测定条件的优化 顶空进样提高灵敏度方法 盐析作用(基质效应), ,在水溶液中 加入无机盐（如无水硫酸钠）来 改变挥发性组分的分配系数。 但当盐浓度小于5%时几乎没有作用，故常用 高浓度(甚至饱和)。 盐析作用对极性组分的影响大于非极性组分的 影响。 在水溶液中加入盐之后，溶液体积会变化，定 量线性范围可能变窄。,7测定条件的优化,顶空进样提高

54、灵敏度方法,有机溶液中加入水：水要与有机溶剂相溶， 减少有机物在有机溶剂中的溶解度，增大其 在顶空气体的含量。,氯仿在dmf顶空法中由于二者结合能力强， 致使其检测灵敏度降低，当加入等量的水 后，检测灵敏度显著增加。即使加水后样品 重新析出，不影响氯仿从样品中转移至溶剂 中的转移率（必须经回收考察）。,7测定条件的优化,顶空进样提高灵敏度方法,调节溶液的ph：对于碱和酸，通过控制ph 可使其解离度改变，或使其待测物的挥发性 变的更大，从而有利于分析。,内径 流量(ml/min),线速度(cm/sec),1/4“ 50-60 2.6-3.2 1/8“ 20-30 4.2-6.3 毛细管柱,0.5

55、3(大孔径) 0.32mm(粗径),3-5 22-38 1-3 20-41,0.20mm(细径) 0.5-1 21-32,0.10mm(快速) 0.2-0.5,42-106,7测定条件的优化 气路优化 可使用下列推荐值来确定不同类型柱的最佳流量 填充柱,8方法学验证,总则：,首先明确将其归为定量检查或限度检查,验证内容,系统适用性 专属性,准确度（回收率） 线性,灵敏度（检测限、定量限 ） 耐用性,8方法学验证,系统适用性,柱效,填充柱法的理论板数应大于1000。,毛细管色谱柱的理论板数应大于5000。,重复性,内标法：对照品溶液连续进样5次，所得被,测物与内标物峰面积之比rsd5%。 外标法：所得被测物峰面积rsd10%。,8方法学验证,专属性,对各种残留溶剂定位和进行混合溶剂的分离 度试验。,考察溶解溶剂、可能残留其他溶剂、主成分、 其他杂质等对测定溶剂是否干扰。,各组分色谱峰与其相邻色谱峰的 分离度应大 于1.5 。,使用ecd进行分离度试验应考虑非卤代烃！,8方法学验证,专属性验证中干扰确定和排除 共出峰干扰 热降解干扰,溶剂介质干扰,吡柔比星中正己烷共出峰的排除,不同物质（极性或氢键形成能力等）在不同极 性色谱柱中具有完全相同保留行为几率很小。,8方法学验证,专属性验证中干扰峰(未知峰)确认