实验一 食品中大肠菌群的测定

1、大肠菌群(M.R.N.)的测定一、实验目的：(1)了解大肠菌群在食品卫生检查中的意义(2)学习和掌握大肠菌群的检查原理和方法，判别食品的卫生质量二、实验原理：大肠菌群是指在37下24小时发酵乳糖，产生氧气发生剂，需要氧气和厌氧的革兰氏阴性芽孢杆菌。 该菌主要来源于人畜粪便，因此将其作为粪便污染的指标来评价食品卫生质量，具有广泛的卫生学意义。 它反映了食品是否被粪便污染，同时间接地指出食品是否有肠道被病原菌污染的可能性。食品中的大肠菌群数系用每100g (或ml )样品大肠菌群的最近数量(themostprobablenumber-简称MPN )表示。 最近的数(mostprobablenumb

2、er-简称MPN )法是将样品“多次(管)无菌稀释”的计数方法。 在9个或15个试管培养基中接种3个稀释梯度的样品稀释液，每稀释度接种3个或5个。 培养后，根据结果调查MPN检索表，可以得到原样品中的微生物的推定数。 MPN的测定方法，特别适用于带菌量极少，用其他方法检测不到的食品。 水、乳制品和其他食品中大肠菌群的计数。三、材料1、样品奶、肉、鸟蛋制品、饮料、点心、发酵调味料、其他食品。2 .菌种大肠杆菌(Escherichia coli )产气肠杆菌3 .培养基和试剂单体乳糖胆盐发酵管，二聚体乳糖胆盐发酵管，乳糖胆盐发酵管，伊红美青琼脂(EMB )，革兰氏染色液，蛋白陈水，靛蓝基质试剂，麦

3、考克(MA )。4 .其他设备和材料温箱(36土1)、水浴锅(44土0.5)、天平、显微镜、均化器和乳钵、温度计、平盘、试管、发酵管、吸管、载玻片、接种针。四、实验程序(1)检查顺序大肠菌群检查程序如图所示(2)操作步骤1 .取样和稀释(具体材料)无菌操作，将生橙子饮料(具体根据实验室提供的决定) 25g (或25mL )放入灭菌生理盐水225mL或其他含有稀释液的灭菌玻璃瓶中(瓶内放入适量的玻璃珠)，放入灭菌乳钵中，充分摇动或研磨，均匀1:10 体检样品为无菌均化器，最好以8000r/mjn10000r/min的速度处理1min，制成1:10的稀释液。用1mL灭菌吸引管吸引1:10ml稀释液

4、，注入含有9mL灭菌生理盐水和其他稀释液的试管中，振荡混合，制成1:100的稀释液，与1根lmL灭菌吸引管交换，通过上述操作，稀释液各增加10倍。根据食品卫生要求和检测样品污染情况的估计，选择三种稀释度，每种稀释度接种三种。 也可以直接用样品接种。2 .乳糖初发酵试验也就是说，是一般所说的假设试验。 其目的是检查样品中发酵乳糖产生气体有无细菌。将预校样品接种到种子乳糖服盐发酵管内，接种量在1mL以上者，二量乳糖胆盐发酵管在1mL和1mL以下者，使用一量乳糖发酵管。 每个稀释度接种3管，放在(36土1)的培养箱内，培养(24土2)h，乳糖胆盐发酵管均可报告为大肠菌群阴性，有发生者则按以下顺序进行

5、。 如果有发起人，请执行以下步骤：3 .分离培养将产气发酵管分别转移到伊红美青琼脂板上，放入(36土1)的烤箱中，培养18h24h，然后取出，观察菌落形态，进行革兰氏染色镜检查和再发酵试验。4 .乳糖再发酵试验也就是说，通常的实证试验的目的是证明从乳糖初酪蛋白管试验显示阳性反应的试管内分离的革兰氏阴性芽孢杆菌使乳糖发酵而产生气体。用上述选择培养基，选择12个可疑大肠菌群进行革兰氏染色，接种乳糖发酵管，(36士l)的烤箱内培养(24土2)h，观察了产气情况。据报道，乳糖发酵管产气.革兰氏染色是阴性反应的无芽胞杆菌，也就是被报告为大肠菌阳性的糖发酵管如果不产生气体发酵剂或革兰氏染色为阳性，大肠菌为

6、阴性。5 .报告根据确认大肠菌群阳性的管数，调查了MPN检索表(参照表5-4 )，报告了每100mL(8)食品中大肠菌群的最大可能数量。5.1试验结果表接种量管号发酵反应的结果有无典型的菌落革兰氏染色的结果再发酵反应的结果最后的结论或-0.1毫升1230.01ml毫升1230.001ml毫升123注：要填写初始发酵和再发酵的结果，必须显示以下符号。 “-”表示既不产生酸也不产生气体，“培养基是紫色的”表示仅产生酸而不产生气体，“”表示培养基变黄，表示产生酸和气体，培养基变黄，有气泡。5.2结果报告证实大肠菌群的阳性管数，在MPN检索表(参照附录)中报告了每100ml大肠菌群的可能数量6 .附件

7、1g样本中的最近似值(MPN )表用三管法接种量分别为0.1、0.01、0.00lg。大肠菌群MPN检索表阳性管数PS95%可靠的限度1毫升(g ) 30.1毫升(g ) 30.01毫升(g ) 3100毫升(g )下限值上限0000000001233030609059000001111012330609012051300000222201236090120160000033330123901301601901111000001234070110150510200210111111110123701101501901030230360111122220123110150200240303601

8、111333301231602002402902222000001239014020026010303603702222111101231502002703403070440890222222220123210280350420401004701500222233330123290360440530333300000123230390640950407015012001300380033331111012343075012001600701403002100230038003333222201239301500210029001503003503800440047003333333301232400460011000240003607101500130002400048000注：本表采用稀释度0.1g(mL )、0.0lg(mL )、0.001g(mL)三种，每种稀释度接种三种。将表内记载的样品量变更为1g(mL )、0.10(mL )和0.01g(mL )时，表内的数字必须减少到10倍。 变更为0.01g(mL )、0.001g(mL )和0.0001g(mL )时，表内的数字增加到10倍，其