DB36T-黑斑蛙米尔伊丽莎白菌分离鉴定技术规范编制说明

关于《黑斑蛙米尔伊丽莎白菌分离鉴定技术规范》地方标准编制说明工作简况（一）任务来源根据《江西省市场监管局关于下达2022年第六批江西省地方标准制修订计划的通知》（赣市监标函〔2022〕24号）的任务安排，江西省农业科学院畜牧兽医研究所等单位承担了《黑斑蛙米尔伊丽莎白菌分离鉴定技术规范》地方标准（计划编号：DB36-2022-6-25）的起草工作。（二）起草单位情况江西省农业科学院畜牧兽医研究所南昌大学江西省农业技术推广中心（三）主要起草人(以表格形式将内容明确)姓名工作单位项目分工刘文舒江西省农业科学院畜牧兽医研究所主要起草者王玉柱江西省农业科学院畜牧兽医研究所主要起草者郭小泽江西省农业科学院畜牧兽医研究所主要起草者李思明江西省农业科学院畜牧兽医研究所主要起草者简少卿南昌大学主要起草者李小勇江西省农业技术推广中心参与试验陈彦良江西省农业科学院畜牧兽医研究所参与试验唐艳强江西省农业科学院畜牧兽医研究所参与试验肖海红江西省农业科学院畜牧兽医研究所参与试验制定（修订）标准的必要性和意义(重要项、需充分说明)（一）必要性近年来，我省黑斑蛙养殖产业迅猛发展，蛙类产量居全国首位。但高密度模式下黑斑蛙免疫力低，各种疾病频发且传播速度快，尤其是类似脑膜炎的“歪头病”。该病传染性极强，死亡率高，给黑斑蛙的养殖造成了巨大的经济损失。经研究发现米尔伊丽莎白菌为该病主要病原，米尔伊丽莎白菌（Elizabethkingiamiricola）是一种革兰氏阴性菌，2016年以来，我省多地的养殖黑斑蛙都爆发了类似脑膜炎的“歪头病”。该病传染性极强，死亡率高，主要症状表现为歪头、白内障、失去定向能力，最终死亡，给黑斑蛙的养殖造成了巨大的经济损失。研究发现黑斑蛙“歪头病”病原为米尔伊丽莎白菌，为黑斑蛙肠道内共生的条件致病菌，可以在蛙类间广泛传播，且耐药性极强。但是关于该菌分离、鉴定技术规范不足，实际生产过程中，一些养殖户乱用药、乱投医，用药过量甚至使用违禁药物的现象，不仅给环境造成巨大压力的同时也引发了药物残留超标的食品安全问题。因而只有在发病初期做好该病原菌的分离与鉴定，进而进行抗生素、中草药等敏感性分析，才能选择合适的药物和合理浓度来预防该病的发生，保障产业的可持续发展。（二）目的与意义本技术规范是通过病原分离培养、分子生物学鉴定等手段，可以达到鉴定米尔伊丽莎白菌的目的。编制该规范的意义在于提供黑斑蛙养殖中导致“歪头病”的米尔伊丽莎白菌的分离、鉴定方法，为针对性药物的筛选奠定基础，减少药物滥用，减低成本，提高产品质量安全。目前，我国以及江西省还没有黑斑蛙米尔伊丽莎白菌分离鉴定相关标准，亟需出台相关技术规程标准予以规范引导“歪头病”病原的鉴定与防治。本标准在编制过程中，尽量直接引用的方式或修改引用相关国家标准、行业标准主要技术内容，确保与相关国家标准、行业标准相协调、相衔接。主要起草过程(必要项)“十三五”期间本团队承担了国家重点研发计划课题《丘陵地区梯田生态立体养殖技术集成与示范》（2018YFD0901703）、江西省农业农村厅的《江西省现代农业产业技术体系项目》（JXARS-10）、江西省重点研发计划《天然植物提取物在黑斑蛙疾病绿色防控中的开发与应用》、江西省协同创新项目等相关任务，涉及到黑斑蛙“歪头病”病原分离和鉴定等工作。项目组依托上述项目支持，紧密结合生产实际问题，针对黑斑蛙病害最为突出的“歪头病”进行病原菌的分离和耐药性调查，我们分离鉴定出一株“歪头病”病原菌米尔伊丽莎白菌JX27（已保藏于中国典型培养物保藏中心），发现其对30种抗菌药物仅有6种敏感，5种中度敏感，19种耐药。与其他地区分离的米尔伊丽莎白菌耐药性结果比较发现耐药性存在地域差异。因此，在实际生产中不根据药敏结果用药，可能根本不能起到疾病防治的效果。表1不同抗菌药物对JX27的抗菌活性抗生素含药量(μg/片)直径（mm）敏感程度抗生素含药量(μg/片)直径（mm）敏感程度1头孢他啶

0R16卡那霉素0R2头孢呋辛

0R17庆大霉素

0R3头孢拉定

0R18丁胺卡那

0R4头孢唑啉

0R19头孢哌酮

17S5头孢氨苄

0R20头孢曲松13R6哌拉西林12I21克林霉素

21S7羧苄西林12I22氯霉素

32S8氨苄西林0R23呋喃唑酮0R9苯唑西林

0R24复方新诺明0R10青霉素

0R25多粘菌素B

0R11红霉素12I26万古霉素

14I12米诺环素

23S27环丙沙星

0R13多西环素

18S28氧氟沙星

11I14四环素0R29诺氟沙星

0R15新霉素0R30麦迪霉素

24SS，敏感；I，中度敏感；R，耐药在永新县高市乡合家种养专业合作社，项目组根据分离鉴定的米尔伊丽莎白菌及其耐药性分析，筛选了敏感型药物并进行试验示范，减少了抗生素的滥用，从源头上减少耐药菌株的产生，降低耐药菌株传播的风险。团队通过以上示范推广确定了本技术模式核心技术的稳定性，提出制定本标准的相关建议，进行标准的初稿拟稿。团队通过资料查阅、调研确定了本标准相关引用技术内容，同过与研究技术成果结合制定了本技术标准，于2021年1月提出立项建议，报送江西省农业农村厅安监局，由江西省质监局标准化处把《黑斑蛙米尔伊丽莎白菌分离鉴定技术规范》列入2022年度第六批江西省地方标准制修订项目计划。为进一步提升本技术标准的科学性和规范性，起草小组征求了5位行业专家意见，根据专家提出的修改意见，对进行标准内容进行了完善和补充，形成征求意见稿，报送江西省农业农村厅安监局。制定（修订）标准的原则和依据，与现行法律、法规、标准的关系(必要项)1.与有关法律法规一致，并与现行有效标准相协调，同时符合我国国情和我省特点。2.编写格式符合GB/T1.1《标准化工作导则第1部分：标准的结构和编写》的要求。3.本标准涉及内容符合以下现行标准要求：GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB/T19489实验室生物安全通用要求《动物病原微生物菌（毒）种保藏管理办法》《中国微生物菌种保藏管理条例》4.本标准与现行农业有关法律、法规、标准不违背或不冲突。5.在充分考虑了标准须具有包容性、先进性、实用性和可操作性的原则上，以前期研究结果和关键技术熟化应用为依据，编制了《稻蛙综合种养生产技术规程》。6.本标准提出8大条涵盖了设备和材料、术语和定义、培养基和试剂、分离和鉴定程序、操作步骤、菌种保存及生物安全措施等技术要点，是在边试验边总结的过程中完成的，已在生产实际中得到检验，科学、规范、可操作性强，对江西省黑斑蛙米尔伊丽莎白菌的分离鉴定具有现实指导意义，对促进我省黑斑蛙“歪头病”的防治具有重要意义。主要条款的说明(重要项)1培养基和试剂除特殊说明，所有实验用水应符合GB/T6682规定的三级水1.1营养肉汤（附录）1.2非选择性细菌培养基（附录）1.3DNAMarker：1Kb1.4扩增片段长度及引物16SrDNA扩增片段长度：约1500bp上游引物序列：27f5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′下游引物序列：1492r5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′gyrB扩增片段长度：约1200bp上游引物序列：gyrB3F5′-TCCGGCGGTCTGCACGGCGT-3′下游引物序列：gyrB14R5′-TTGTCCGGGTTGTACTCGTC-3′1.5灭菌生理盐水:0.6%1.610×PCR缓冲液1.7Taq聚合酶（0.5U/µL）1.8dNTPs（2mmol）1.91.2%琼脂糖凝胶（附录）1.1050×TAE缓冲溶液（附录）1.111×TAE缓冲溶液（电泳缓冲液）（附录）1.12核酸染料：GelRed2操作步骤2.1采样①病蛙采集回实验室后，用清水清洗蛙体，置无菌操作台紫外线灭菌待用；②将病蛙置于冰水混合物中低温麻醉或对病蛙进行毁髓法操作；③待病蛙完全进入麻醉状态后，取出病蛙，用吸水纸吸去体表水分；④用酒精棉球（75%消毒酒精）对病蛙体表和眼部消毒；⑤将杀菌消毒后的病蛙置于无菌操作台内的托盘上，选取眼部病变明显处，用镊子和手术剪刀进行采样。2.2病菌的培养①在无菌状态下将所采病变组织进行剪碎或匀浆；②将剪碎或匀浆后的组织液与营养肉汤按照1:10比例进行混合，恒温培养箱（36℃±1℃）培养24h，观察；③将培养好的菌悬浊液摇晃均匀，在无菌状态下划线接种于无菌非选择性培养基中，恒温培养箱（36℃±1℃）培养24h，观察；④选取可疑菌落接种于新的无菌非选择性培养基中，温培养箱（36℃±1℃）培养24h，待进一步鉴定。2.3病菌样品的鉴定2.3.1形态学鉴定菌落颜色为米色或淡黄色，边缘整齐，半透明，表面湿润、光滑。2.3.2分子生物学鉴定2.3.2.1PCR模板的制备接种环挑选培养基上待检菌的单独菌落，置于0.5ml灭菌生理盐水中，4000r/min离心2min，弃上清。再加0.5mL无菌水重悬并涡旋混匀，100℃沸水中煮沸10min后，移至冰面上，冷却后4000r/min离心30s，取上清液作为PCR模板待用。2.3.2.2PCR反应体系的配制根据PCR试剂用量，配制PCR反应体系。2.3.2.3PCR反应条件16SrRNA扩增条件：95℃预变性5min，94℃变性30s，64℃退火30s，72℃延伸90s，共32个循环，最后72℃延伸10min。gyrB扩增条件：95℃预变性5min，94℃变性30s，64℃退火30s，72℃延伸30s，共32个循环，最后72℃延伸10min。2.3.2.4电泳及成像观察取5µLPCR扩增产物和1µL上样缓冲液，混匀后加入1.2%琼脂糖凝胶电泳加样孔中，同时在空白孔加入Marker标准品。电泳结束后，取出凝胶板置于紫外投射仪上，打开紫外灯观察或用凝胶成像仪进行成像观察，确定PCR效果。2.3.2.5基因序列测序将扩增产物进行基因序列的测定，在NCBI对比，与已有基因同源性高于98%即可确定为米尔伊丽莎白菌。3菌种保存及生物安全为了保护实验室人员的安全，应由具备专业知识的人员进行检测，所有培养物和废弃物应参照GB/T19489及国家有关规定执行。菌种应由具备专业相关资质的实验室根据《动物病原微生物菌（毒）种保藏管理办法》《中国微生物菌种保藏管理条例》进行妥善保存。重大意见分歧的处理依据和结果(必要项)该标准是在近三年的试验与实践总结的基础上总结形成的，在标准撰写过程中，没有出现重大意见分歧，在标准的实施过程中，有待于广泛征求广大科研、生产、管理等单位的意见，依据我国我省实际情况，按照标准化的原则，协商解决分歧意见