DB12-T 1189-2023 牛亲子鉴定技术规程

ICS65.020.30CCSB4312TechnicalspecificationforparentageidentificationDB12/T1189—2023本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。本文件由天津市农业农村委员会提出并归口。本文件起草单位：天津市农业科学院。本文件主要起草人：马毅、赵欣、陈丽丽、张漫、谭冬飞、赵康、芦娜、王丽学。IDB12/T1189—2023牛亲子鉴定技术规程本文件规定了牛亲子鉴定的技术方法。本文件适用于牛（Bostaurus）亲子鉴定。2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和实验方法GB/T27642牛个体及亲子鉴定微卫星DNA法NY/T1672绵羊多胎主效基因FecB分子检测技术规程SN/T1193基因检验实验室技术要求3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1等位基因数allele，A反映群体遗传变异大小的一个指标，其数值越接近所检测到的等位基因的绝对数，表明等位基因在群体中分布越均匀。3.2期望杂合度heterogosity，He期望杂合度主要是根据种群内当前优势等位基因的分布频率来推算的，稀有基因的贡献极其微弱。3.3多态信息含量polymorphicinformationcontent，PICDNA的多态性指标。Pi和Pj分别为第i个和第j个等位基因频率，n为等位基因数。3.4排除概率PE在亲子鉴定中一个随机的个体被排除为亲生父亲的概率，是评价微卫星标记在亲子鉴定中实用价值大小的一个指标。1DB12/T1189—2023(1)当没有另一亲本信息时，排除子代与假设亲本是亲子关系的排除概率：(2)累计排除概率：CPE=1-(1-P1)(1-P2)…(1-Pk)3.5微卫星DNAmicrosatellite又称短串联重复序列（STR）或简单重复序列（SSR一类广泛存在于真核生物基因组中的，核心序列为2～6bp，重复次数通常为15～30次的DNA串联重复序列。3.6多重聚合酶链反应multiplexPCR又称多重引物PCR或复合PCR，在同一PCR反应体系中加入两对以上引物，同时扩增出多个核酸片段的PCR反应。4鉴定原理利用常染色体微卫星分型技术，选取不同染色体上的微卫星位点，采用多重PCR技术扩增微卫星标记，检测微卫星位点的遗传多态性，分型得出各位点等位基因的大小，通过软件统计分析，确定或排除亲子关系。5试剂配制水为符合GB/T6682的一级水；高压灭菌条件为1.034×105Pa压力，蒸汽灭菌20min。试剂配制如——ACD抗凝剂：柠檬酸0.48g、柠檬酸钠1.32g、葡萄糖1.47g，定容于100mL水中，高压灭菌；——10%SDS（十二烷基硫酸钠）：100gSDS溶于90mL水中，加热至68℃助溶，用HCl调pH至7.2，定容至1000mL，0.2μm的滤膜过滤，高压灭菌；——PBS（磷酸缓冲液）：8gNaCl、0.2gKCl、1.44gNa2HPO4、0.24gKH2PO4溶于800mL蒸馏水中，用HCl调pH至7.4，加水定容至1000mL，高压灭菌，室温保存；——0.5mol/LNaCl（氯化钠）：5.844gNaCl溶于双蒸水中，加水定容至200mL，高压灭菌；——蛋白酶K（20mg/mL）：200mg蛋白酶K定溶于10mL水中，以1mL分装，-20℃冷冻保存；——氯仿：异戊醇（24：1）：异戊醇2mL加入到500mL的氯仿试剂瓶中，混匀；——1mol/LTris-HCl（pH=8）：将121.1gTris溶于800mL水中，加浓盐酸调pH至8.0，容至1000mL，高压灭菌；——0.5mol/LEDTA（pH=8）：800mL水中加入186.1gEDTA-Na2·2H2O（二水合乙二胺四乙酸二钠），在磁力搅拌器上剧烈搅拌，用NaOH调节溶液pH至8.0，然后容至1000mL，高压灭——TE缓冲液：取1mol/LTris-HCl（pH=8）10mL，0.5mol/LEDTA（pH=8）2mL，加水定容至1000mL，高压灭菌，室温保存；2DB12/T1189—2023——血样裂解液：1mol/LTris-HCl（pH=8）1mL，0.5mol/LEDTA（pH=8）20mL，10%SDS5mL，双蒸水74mL；——精子DNA抽提液：称取二硫苏糖醇0.06g与1mL0.5mol/LTris-HCl，0.5mol/LEDTA，0.5mol/LNaCl，2mL10%SDS混合后，补水至10mL；——50×TAE缓冲液：Tris-base242g，冰乙酸57.1mL，0.5mol/LEDTA（pH=8）100mL，加水定容至1000mL。使用时稀释50倍或100倍即1×TAE；——2%琼脂糖：2g琼脂糖充分溶解于50×TAE，定容至100mL；——琼脂糖电泳上样缓冲液：0.25%溴酚蓝；0.25%二甲苯菁FF；40%蔗糖水溶液；——10×Buffer：0.05%色素溴酚蓝；——MgCl2（50mmol/L）：分子量为95.211，计算配制所需固体溶质的质量，用托盘天平称取固体MgCl2加入一级水溶解；——dNTP（10mmol/L）：dNTP溶于pH为7.0的NaOH贮存液中，最初的贮存液可稀释到10mol/L，分装后存放在-20℃冰箱中；——TaqDNA聚合酶：TaqDNA聚合酶长为832个氨基酸,分子量为94Kd。该酶可以广泛用于PCR、RT-PCR和加尾反应等；——GoldView：可代替溴化乙锭（EB）的新型核酸染料；——6×DNALoadingBuffer：0.05%色素溴酚蓝；0.05%二甲苯菁FF；——2000bpDNAMarker：2000DNAMarker是由2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp以及100bp共6条线状双链DNA片段组成，保存于1×DNALoadingBuffer中，可直接用于电泳分析；——去离子甲酰胺：产品规格：100mL，分子式：CH3NO，分子量：45.04；——四甲基罗丹明（TAMRA）：溶剂：DMSO，储存条件20。C干燥避光保存有效期为12个月。6仪器设备6.1单道可调移液器0.25～2.5μL、1～10μL、2～20μL。6.2基因扩增仪温度范围0～99℃,样品规格96×0.2mL，反应体积10～100μL。6.3离心机最高转速12000r/min，最大容量24×1.5mL。6.4恒温振荡器0～200r/min，0～60℃。6.5电子天平万分之一精度。6.6旋涡混合器转速2800r/min，工作台直径110mm。3DB12/T1189—20236.7手持式均质器转速范围5000～35000rpm，处理量0.05～100ml。6.8紫外分光光度计波长范围200～1000nm。6.9凝胶成像分析系统有胶像素1280×1024，检测灵敏度DNA≥0.05ng。6.10稳压稳流电泳仪输出电压0～600V，输出电流0～100mA。6.11水平电泳槽外形尺寸182mm×85mm×5mm，凝胶板面积60mm×60mm。6.12高压灭菌锅使用温度范围45～135℃,最高使用压力0.255Mpa。6.13自动双重纯水蒸馏器功率3000W，出水量2500mL/h。6.14微波炉容积20L。6.15干燥箱温控范围50～300℃,箱内尺寸350mm×350mm×450mm。6.16冰箱7检测方法7.1样本采集与保存静脉采集血样3～5mL，复方枸橼酸钠注射液（ACD）抗凝，4℃可以保存3～5d，-20℃可以保存一个月，-80℃可以保存一年。对公牛，亦可采集2～3剂细管精液，液氮保存。7.2DNA提取按GB/T27642规定的方法执行。7.3DNA浓度和纯度检测按NY/T1672的规定执行。4DB12/T1189—20237.4引物序列引物序列参考联合国粮农组织（FAO）和国际动物遗传学会（ISAG）的推荐引物。9个微卫星标记分为4个扩増组合，具体按照附录A。7.5PCR扩増7.5.1多重PCR扩増体系产物扩增分4次PCR反应完成。同一扩増组合的引物加入同一PCR反应管中，25μL反应体系：10×Buffer2.5μL、50mmol/LMgCl21.2μL、10mmol/LdNTP0.6μL、TaqDNA聚合酶2μL、10μmol/L引物（扩増组合）各1.0μL、待测个体模板DNA（或者阳性对照DNA）100ng、加一级水至反应总体积为25μL。PCR扩增时设计阴性对照（一级水作为模板）。7.5.2PCR扩増条件94℃预变性5min；94℃变性30s，57～60.5℃退火30s，35个循环；72℃延伸5min，4℃保存。7.6PCR产物琼脂糖凝胶电泳检测7.6.1先用水清洗制胶板，再用1×TAE冲洗一次，水平放置。7.6.2根据电泳胶板的规格和检测样品的数量，配制2%的琼脂糖溶液，在微波炉中加热融化至溶液澄清透明，室温下冷却至60℃时，加入goldview并混匀，使goldview的终浓度为0.5μg/L。7.6.3将混合液缓慢倒入制胶板中，排除气泡，插入多齿梳子。待凝胶凝固后，拔出梳子，将凝胶转移至水平电泳槽中，往电泳槽中加入1×TAE缓冲液，使电泳缓冲液没过胶面。7.6.4将待检PCR产物5μL和上样缓冲液（6×DNALoadingBuffer）以5：1的比例混合均匀，加入点样孔；同时选择点样孔点上5μL2000bpDNAMarker作参照。恒压100V，电泳30min。电泳结束后于凝胶成像系统观察，并分析记录。7.7微卫星DNA多态性分析PCR产物、去离子甲酰胺和TAMRA内标按0.5μL：10μL：0.5μL比例混合，95℃变性15min，遗传分析仪测序，配套软件分析微卫星的基因型。FAM、HEX和TANRA分别表示蓝色、绿色和黑色。8结果判定8.1多重PCR产物检测若多重PCR均出现清晰条带，表明产物扩增成功，可以进行测序，见图1。5DB12/T1189—2023图1多重PCR产物2%琼脂糖凝胶电泳图8.2微卫星标记分型利用遗传分析仪对微卫星标记进行基因分型。检测个体的9个微卫星标记的基因分型结果，根据相对荧光强度和片段大小，可获得待测个体不同STR标记的基因型。不同亲缘关系的个体，其微卫星标记的等位基因大小不同，表现出不同的基因型，阳性对照样品9个STR标记不同等位基因的大小按附录B所示。8.3亲子关系判定根据待检个体STR标记的基因型，计算其等位基因数（A）、期望杂合度（He）和多态信息含量（PIC）等指标分析微卫星标记多态性，计算累积非父排除概率（CPE）分析标记的亲子鉴定效力（按照附录C）。根据孟德尔遗传定律以及STR位点分型来判断亲子关系，如果两者之间孟德尔错误的位点数是0，则判断为亲子关系。9废弃物处理按照NY/T1672的规定执行。10交叉污染防止措施按照SN/T1193的规定执行。6DB12/T1189—2023（规范性）微卫星基因座及其引物序列微卫星基因座及其引物序列见表A.1。表A.1微卫星基因座及其引物序列1GCTTTCAGAAATAGTTTGCATCTTCACATGATATTACAGCAGAGTAGAGCTACAAGATAATAACTACAGGGTGTTAGATG2AATCACATGGCAAA