新教材高中生物选择性必修3课件1：2 2 2 动物细胞融合技术与单克隆抗体(人教版)

第2章细胞工程第2节第2课时动物细胞融合技术与单克隆抗体想要制备大量特异性抗体，浆细胞能产生特异性抗体但无法增殖且寿命有限，而癌细胞能大量增殖，但是没有产生抗体的能力。讨论：有没有一种方法能获得兼具两者功能的细胞？问题探讨诱导动物细胞融合一、动物细胞融合技术概述使_______或_______动物细胞结合形成______细胞的技术形成的__________具有______________________________两个多个一个杂交细胞原来两个或多个细胞的遗传信息细胞膜具有一定的流动性PEG融合法电融合法灭活病毒诱导法*其中灭活病毒诱导法是动物细胞融合特有的诱导融合方法突破了有性杂交的局限，使远缘杂交成为可能一、动物细胞融合技术概述1概念：2结果：3原理：4意义：5诱导融合的常用方法：相关信息了解1.“灭活病毒”中灭活的具体含义是什么？思考用物理或化学手段使病毒或细菌失去感染能力，但并不破坏它们的抗原结构病毒表面含有的糖蛋白和一些酶能够与细胞膜上的糖蛋白发生作用，使细胞互相凝聚，细胞膜上的蛋白质分子和脂质分子重新排布，细胞膜打开，细胞发生融合2.灭活病毒诱导细胞融合的原理是什么？一、动物细胞融合技术概述①细胞融合技术已经成为研究__________、__________、_______和________________等的重要手段②利用动物细胞融合技术发展起来的____________，为________________开辟了新途径细胞核的融合细胞遗传细胞免疫肿瘤培育生物新品种杂交瘤技术制造单克隆抗体一、动物细胞融合技术概述6融合实质及完成的标志：7应用：二、动物细胞融合和植物体细胞杂交比较植物体细胞杂交动物细胞融合原理细胞融合前的处理方法诱导细胞融合的方法细胞融合成功的标志用途意义细胞膜具有一定的流动性植物细胞的全能性细胞膜具有一定的流动性用果胶酶和纤维素酶去除细胞壁用胰蛋白酶或胶原蛋白酶使细胞分散成单个细胞电融合法、离心法；聚乙二醇（PEG）融合法、高Ca2+-高pH融合法PEG融合法电融合法灭活病毒诱导法再生出细胞壁细胞核的融合获得完整的杂种植株主要用于制造单克隆抗体打破生殖隔离，实现远缘杂交育种，培育植物新品种突破了有性杂交的局限，使远缘杂交成为可能二、动物细胞融合和植物体细胞杂交比较三、单克隆抗体的制备（1）早期获得抗体的方法________________________________________________________________________________________（2）上述抗体的缺点：（3）大量制备单一抗体的思路和需解决的问题向动物体内反复注射某种抗原，使动物产生抗体，然后从动物血清中分离所需抗体产量低、纯度低、特异性差每一个B淋巴细胞只分泌一种特异性抗体单一B淋巴细胞细胞群选择克隆产生大量纯度高特异性强的抗体一个B淋巴细胞不可能无限增殖三、单克隆抗体的制备1.研究背景能产生单一的特异性抗体，但不能无限增殖癌细胞能在体外大量增殖，但不能产生抗体动物细胞融合1.B细胞的特点（优点和局限性）*？思考2.哪种细胞可以无限增殖？3.癌细胞的特点（优点和局限性）*？4.有什么办法能得到既能迅速大量增殖又能产生大量特定抗体的细胞？三、单克隆抗体的制备（4）单克隆抗体制备思路一种B淋巴细胞（只产生一种特定抗体）能在体外大量增殖的骨髓瘤细胞动物细胞融合杂交瘤细胞动物细胞培养大量的特定抗体米尔斯坦科勒由于发明了单克隆抗体的制备技术，米尔斯坦和科勒于1984年获得了诺贝尔生理学或医学奖三、单克隆抗体的制备注射特定的抗原多种B淋巴细胞骨髓瘤细胞诱导融合①未融合的细胞②多种杂交细胞（包括B-B细胞、瘤-瘤细胞、杂交瘤细胞）动物细胞融合三、单克隆抗体的制备2.过程①未融合的细胞②多种杂交细胞杂交瘤细胞抗体检测呈阳性的杂交瘤细胞（能产生特定抗体的杂交瘤细胞）用特定的选择培养基第一次筛选克隆化培养、抗体检测第二次筛选（可进行多次）注射到小鼠腹腔内体外培养获取单克隆抗体从小鼠腹水中从细胞培养液中动物细胞培养三、单克隆抗体的制备①未融合的细胞②多种杂交细胞杂交瘤细胞抗体检测呈阳性的杂交瘤细胞（能产生特定抗体的杂交瘤细胞）用特定的选择培养基第一次筛选克隆化培养、抗体检测第二次筛选（可进行多次）注射到小鼠腹腔内体外培养获取单克隆抗体从小鼠腹水中从细胞培养液中注射特定的抗原多种B淋巴细胞骨髓瘤细胞诱导融合动物细胞融合动物细胞培养三、单克隆抗体的制备（1）该过程中应用到的技术：（2）原理：（3）注射特定抗原的目的：（4）诱导融合的方法：

动物细胞特有的为______________动物细胞融合、动物细胞培养细胞膜具有一定的流动性、细胞增殖用特定的抗原对小鼠进行免疫，并从该小鼠的脾中得到能产生特定抗体的B淋巴细胞PEG融合法、电融合法、灭活病毒诱导法*不是为了得到抗体！灭活病毒诱导法三、单克隆抗体的制备未融合的亲本细胞两两融合的细胞融合的具有同种核的细胞融合的杂交瘤细胞B-B细胞瘤-瘤细胞三、单克隆抗体的制备只考虑两两融合，诱导融合之后，一定会得到所需的杂交瘤细胞吗？思考（5）第一次筛选的目的：（6）如何筛选：（7）筛选原理：（8）杂交瘤细胞的特点：筛选获得杂交瘤细胞用特定的选择培养基进行筛选在选择培养基上，未融合的亲本细胞和融合的具有同种核的细胞都会死亡，只有融合的杂交瘤细胞才能生长既能迅速大量繁殖，又能产生抗体三、单克隆抗体的制备①细胞合成DNA有两条途径，正常细胞内两种途径都有，若全合成途径被阻断，可以通过补救合成途径合成DNA；②骨髓瘤细胞不能合成转化酶和激酶，因此只能进行全合成途径；③全合成途径能被氨基喋呤（A）阻断；④次黄嘌呤（H）、胸腺嘧啶（T）是补救合成途径的原料；⑤无增殖能力的细胞在培养基中存活仅5-7天，细胞的多聚体也容易死去；将诱导融合后的细胞接种于HAT培养基后两周，则细胞生存状况及原因为：B细胞和B-B细胞：___________________________________________骨髓瘤细胞和瘤-瘤细胞：____________________________________________________杂交瘤细胞：___________________________________________________死亡；能进行补救合成途径，但是无增殖能力；死亡；两种途径均无法进行，无法合成DNA，无法增殖；存活；能进行补救合成途径，能合成DNA，可大量增殖；三、单克隆抗体的制备补充了解——HAT培养基的筛选原理杂交瘤细胞并不纯，因为从脾脏获得的B淋巴细胞不纯（既有未免疫的B淋巴细胞，又有产其他抗体的B淋巴细胞，以及能产所需抗体的B淋巴细胞），因此要进行第二次筛选；三、单克隆抗体的制备得到的杂交瘤细胞一定是所需的吗？思考（9）第二次筛选的目的：（10）如何筛选：（11）选择抗体检测呈_____性的杂交瘤细胞，即__________________________________（12）抗体检测原理：获得足够数量的能分泌所需抗体的杂交瘤细胞用96孔板培养，在每一个孔中尽量只接种一个杂交瘤细胞的情况下，进行克隆化培养和抗体检测（进行多次筛选）阳分泌的抗体能与特定的抗原结合抗原和抗体能够特异性结合(分子水平的鉴定）三、单克隆抗体的制备补充了解——克隆化培养和抗体检测★有限稀释法每一个孔中尽量只接种一个杂交瘤细胞侧面模拟图克隆化培养一段时间取上清液进行抗体检测三、单克隆抗体的制备补充了解——不同水平的克隆及实例分子水平细胞水平个体水平DNA复制、PCR技术动物细胞培养植物组织培养、动物细胞核移植细胞水平三、单克隆抗体的制备单克隆抗体的制备涉及什么水平的克隆？思考（13）如何获取大量所需杂交瘤细胞？（14）如何获取单克隆抗体①体外培养：②小鼠腹腔内培养：（15）单克隆抗体的优点：在体外条件下大规模培养（接种于培养液中）或注射到小鼠腹腔内增殖从细胞培养液中获取从小鼠腹水中获取能准确地识别抗原的细微差异，与特定抗原发生特异性结合，并且可以大量制备老课本：特异性强、灵敏度高、并可大量制备三、单克隆抗体的制备现学现用：请用箭头把以下部分步骤的字母按正确顺序连接起来BAECGDHF三、单克隆抗体的制备第一次筛选第二次筛选原因方法结果诱导融合后得到的细胞中，除杂交瘤细胞之外，还有未融合的亲本细胞，也有融合的具有同种核的细胞由于小鼠在生活中还受到其他抗原的刺激，所以经第一次筛选之后获得的杂交瘤细胞中有能产生其他抗体的细胞用特定的选择培养基进行筛选用96孔板培养，在每一个孔中尽量只接种一个杂交瘤细胞的情况下，进行克隆化培养和抗体检测（进行多次筛选）筛选获得杂交瘤细胞获得足够数量的能分泌所需抗体的杂交瘤细胞三、单克隆抗体的制备试比较两次筛选的原因、方法和结果。思考四、单克隆抗体的应用四、单克隆抗体的应用抗体主要发挥靶向运输作用，即通过特异性结合靶细胞表面的抗原，将连接的药物输送到靶细胞；药物发挥治疗效应，如杀伤靶细胞ADC的抗体和药物各具有什么作用？讨论1四、单克隆抗体的应用①可以用放射性同位素标记单克隆抗体进行靶向放疗；②一些作用于细胞信号转导通路的药物可以通过阻断肿瘤细胞的信号通路来抑制其生长，理论上也可以将这些药物与单克隆抗体结合进行治疗四、单克隆抗体的应用除了细胞毒素，还有哪些物质理论上可以作为ADC偶联的药物？讨论2①单克隆抗体诊断试剂盒中的单克隆抗体只与特定的抗原反应，因此检测的特异性和灵敏度大大提高；生产单克隆抗体的杂交瘤细胞可以传代培养、冷冻保存和复苏利用，有利于控制产品的质量和标准化生产诊断试剂盒；②ADC能够协同发挥抗体特异性识别的靶向作用和细胞毒素对肿瘤细胞的杀伤作用，因此它在临床上具有靶点清楚、毒副作用小等优点四、单克隆抗体的应用单克隆抗体诊断试剂盒和ADC在临床应用上各具有什么优势？讨论3（1）原理：（2）具体应用及部分实例：①多种疾病的诊断实例：利用同位素或荧光标记的单克隆抗体在特定组织中成像的技术，可定位诊断肿瘤、心血管畸形等疾病②病原体的鉴定实例：乙肝病毒表面抗原定量检测试剂盒③其他类型诊断实例：早早孕诊断试剂盒单克隆抗体能准确地识别抗原的细微差异，与特定抗原发生特异性结合四、单克隆抗体的应用1.用作诊断试剂（1）具体应用实例与药物结合，制成_____________________，杀伤癌细胞；ADC通常由_______、_______和_______三部分组成；（2）原理通过将药物与________________________的单克隆抗体结合，实现对肿瘤细胞的_____________；发挥杀伤作用的为_________________________________；单克隆抗体作用为_____________；（3）优点：

抗体-药物偶联物（ADC）抗体接头药物能特异性识别肿瘤细胞抗原选择性杀伤放射性同位素、化学药物或细胞毒素靶向运输作用靶点清楚、毒副作用小（不会对健康细胞造成伤害）四、单克隆抗体的应用2.运载药物单克隆抗体单独使用，也可直接用于治疗疾病；实例：利妥昔单抗（美罗华）是一种针