牛人工授精技术规程

1DB43/TXXXX—2022牛人工授精技术规程本文件牛冷冻精液人工授精的操作技术要求、记录。本规程适用于我省母牛人工授精技术应用。2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T4143牛冷冻精液GB/T5458液氮生物容器NY/T1234牛冷冻精液生产技术规程NY/T1335牛人工授精技术规程3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1冷冻精液frozensemen将原精液用稀释液等温稀释、平衡后快速冷冻，在液氮中保存。冷冻精液指细管冷冻精液。3.2冷冻精液解冻thawingoffrozensemen冷冻精液使用前使冷冻精子重新恢复活力的处理方法。3.3人工授精artificialinsemination用人工方法采取公牛精液，经检查处理后，输入发情母牛生殖道内，使其受胎的技术。3.4发情鉴定estrusdetection通过外部观察或其他方式确定母牛发情程度的方法。3.5情期受胎率conceptionrateofsaneinsemination同期受胎母牛数占同期输精情期数的百分比。3.6受胎率conceptionrate同期受胎母牛数占同期参加输精母牛数的百分比。3.7繁殖率reproductiverate2DB43/TXXXX—2022同期分娩母牛数占同期应繁殖母牛数的百分比。4牛基本条件4.1种公牛和精液品质应符合GB/T4143的要求。4.2母牛健康、繁殖机能正常的未妊娠母牛。5输精准备5.1器具清洗和消毒凡是接触精液和母牛生殖道的输精用器具都应进行清洗和消毒（见附录A）。5.2冷冻精液的贮存冷冻精液应浸泡在液氮生物容器中贮存，液氮生物容器应符合GB/T5458有关规定。包装好的冷冻精液由一个被氮容器转换到另一液氮容器时，在被氮容器外停留时间不得超过5s。5.3冷冻精液解冻冷冻精液的解冻方法应符合GB/T4143的要求。5.4精液质量检查精液质量应符合GB/T4143的要求。5.5牛体卫生输精前，用于掏净母牛直肠宿粪后，再用温水清洗母牛外阴部并擦拭干净。5.6输精器准备采用金属输精器。剪去细管精液封口，剪口应正，断面应齐。将剪去封口的细管精液迅速装入输精器管内，步骤为：剪去封口端的为前端，输精器推杆后退，细管装至管内，输精器管进入塑料外套管，管口顶紧外套管中固定圈，输精器管前推到头，外套管后部与输精器后部螺纹处拧紧，卡式的外套则要推入卡槽里，全部结合要紧密。6母牛发情鉴定6.1外部观察3DB43/TXXXX—2022通过母牛的外部表现症状和生殖器官的变化判断母牛是否发情和发情程度（见附录B)。6.2直肠检查通过直肠检查卵巢，触摸卵泡发育程度，判断发情程度及排卵时间（见附录B）。7输精7.1输精时间确定7.1.1触摸卵泡在卵泡壁薄、满而软、有弹性和波动感明显接近成熟排卵时输精一次；6h-10h卵泡仍未破裂，再输精一次。7.1.2外部观察法母牛接受爬跨后6h-10h是适宜输精时间。如采用两次输精，第二次输精时间为母牛接受爬跨后12h-20h。青年母牛的输精时间宜适当提前。7.2直肠把握输精法输精人员一手五指并握，呈圆锥形从肛门伸进直肠，动作要轻柔，在直肠内触摸并把握住子宫颈，使子宫颈把握在手掌之中，另一手将输精器从阴道下口斜上方约45°角向里轻轻插入，双手配合，输精器头对准子宫颈口，轻轻旋转插进，过子宫颈口螺旋状皱壁到达子宫体2cm-3cm即为输精部位。一头母牛应使用一支输精器或者一支消毒塑料输精外套管。直肠把握输精，使用金属输精器，注入精液前略后退约0.5cm，把输精器推杆缓缓向前推，通过细管中棉塞向前注入精液。7.3输精部位应到子宫体部，即子宫颈后端与子宫角间沟分岔部中间部位，不宜深达子宫角部位。8妊娠检查8.1外部观察妊娠母牛外部表现发情周期停止，食欲增进，毛色润泽，性情变温和，行为变安稳。怀孕中后期腹国增大，腹壁一侧突出，甚至可观察到胎动，乳房胀大。输精后二个情期未发情（40d左右通过直肠触摸检查子宫，可查出两侧子宫角不对称，孕侧子宫角较另侧略大，且柔软。60d后直肠触摸可查出妊娠子宫增大、胎儿和胎膜。直肠触摸同侧卵巢较另4DB43/TXXXX—2022侧略大，并有妊娠黄体，黄体质柔软、丰满，顶端能触感突起物。8.3超声波诊断用B超检查母牛的子宫及胎儿、胎动、胎心搏动等。对配种28d后的牛采血，用检测试剂盒（PAG-ELISA）测定PAGs，按检测试剂盒说明书操作，或见9记录9.1记录内容包括母牛号、母牛发情时间、发情观察鉴定、发情后期流血时间、输精时间、公牛号及冷冻精液信息、输精操作人员。上述内容可以表格的方式记录，见附录D。9.2情期受胎率情期受胎率按式（1）计算。式（1）:F=F*I/I*100-----(1)式中：F----情期受胎率，%。F*I----同期受胎母牛数，头。I----同期输精情期数，头.次。受胎率按式（2）计算。式（2):C=C1/I*100---------(2)式中：C----受胎率，%；C1----同期受胎母牛数，头；I-----同期输精母牛数，头。9.4繁殖率繁殖率按式（4）计算。式（4):R=C/I*100---------(4)式中：5DB43/TXXXX—2022R-----繁殖率，%；C-----同期产犊母牛数，头；I-----同期应繁殖母牛数，头。6DB43/TXXXX—2022（规范性附录）输精器具的清洗和消毒A.1玻璃器皿使用前用水浸泡和洗涤，有污物的宜用加洗涤剂的温热水或重络酸饵洗液浸泡数小时后，用水洗净凉干备用。玻璃输精管放置在电热干燥箱160℃保持0.5h，自然冷却后待用。A.2金属器械金属输精器类洗净后，置电热干燥箱120℃保持lh，自然冷却待用。7DB43/TXXXX—2022（资料性附录）发情外部表现症状和生殖器官的变化母牛发情外部表现症状和生殖器官的变化见表B.l表B.1发情鉴定外部表现症状和生强器官的变化母牛母牛游走减少，其它牛爬跨时站立不动、后肢张开，频频举血，黏液显著增加，流出大量透明卵泡增大，波动明显，泡壁由厚变薄8DB43/TXXXX—2022（资料性附录）配种记录表123459DB43/TXXXX—2022（规范性附录）妊娠特异性糖蛋白（PAGs）诊断A.1采集血样品用一次性采血针和5mL采血管，对配种28-30d的母牛尾根酒精消毒采血2mL-3mL,采血管做好标记和填写采样单，静置1小时，3000g离心10min，离心后血清可直接用于检测，不立即检测的血清转入新的离心管，在-20℃冰箱内保存。A.2准备检测用品准备手套、吸管、洗瓶、移液枪、枪头等，将试剂盒、样品恢复至室温，摇匀试剂。A.3加样反应A.3.1将微孔板置于平整干净的台面上，用吸管分别向微孔内加入50μL缓冲液，再加标准品（阳性对照和阴性对照）和待测样品150μL填写加样登记单，记录下每个微孔的位置，确认加样准确无误。A.3.2用封口膜将微孔板密封以防蒸发，轻轻摇匀，在20℃的恒温培养箱孵育1小时。A.3.3孵育后，去掉膜，翻转微孔板，倒掉孔内液体，再用洗液清洗微孔4次。A.3.4洗涤后，向微孔内加入检测溶液，轻轻摇匀，再在在20℃的恒温培养箱孵育1小时。A.3.5孵育后，重复步骤A.3.3的洗板过