DB32T3451-2018栽培稻种中杂草稻混杂检测规程

ICS65.020.20

B22

备案号：DB32

江苏省地方标准

DB32/T3451—2018

栽培稻种中杂草稻检测规程

TestingregulationsofWeedyRiceinCultivatedRice’sSeed

2018-09-06发布2018-09-30实施

江苏省质量技术监督局发布

DB32/T3451—2018

栽培稻种中杂草稻检测规程

1范围

本标准规定了杂草稻的术语和定义、试剂配制、仪器和用具、照明要求、样品制备、操作步骤、结

果计算等方面的内容。

本标准适用于栽培稻稻种中杂草稻的检测。

2规范性引用文件

下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。

凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。

GB5491粮食、油料检验扦样、分样法

GB/T22505粮油检验感官检验环境照明

3术语和定义

下列术语和定义适用于本文件。

3.1

杂草稻weedyrice

杂草稻(weedyrice)是指在水稻田中可以自我繁衍具有杂草特性的水稻（OryzasativaL.）物种。

3.2

纯合体的杂草稻homozygoticweedyrice

栽培稻种子中具有红果皮的杂草稻。

3.3

杂合体的杂草稻heterozygousweedyrice

杂草稻的花粉飘逸到栽培稻柱头上发生杂交，产生的栽培稻种子（2n=24条染色体）中含有杂草

稻的一半染色体（n=12条染色体），但果皮色依然表现为白色。称为杂草稻杂合体。其种植到田里开

花结果，就会产生性状分离，产生具有红色果皮的杂草稻种子。

3.4

Rc基因Rcgene

Rc基因是水稻果皮原花色素积累途径中最重要的调节基因之一,位于第７染色体上,全长约6.4kb,

包含有8个外显子,产物为一个具有碱性螺旋-环-螺旋(bHLH)元件的调节蛋白。Rc基因具有比rc基因多14

bp插入/缺失，从而设计特异性14bp插入/缺失引物进行PCR扩增，以检测杂合体杂草稻。

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4检测前准备工作

4.1试剂配制

聚丙烯酰胺母液（40%）：按19:1的比例将38g丙烯酰胺和2g甲叉双丙烯酰胺加入100ml去离

子水中，待溶解后定容，于4℃冰箱中储存备用。5xTBE电泳缓冲液1L（母液）：54gTrisbase，

27.5g硼酸，20ml0.5MEDTA（pH8.0），加蒸馏水至1L。10%过硫酸铵：1g过硫酸铵溶于10ml蒸

馏水中，4℃冰箱中保存1周左右。400mLNaOH溶液：6g氢氧化钠，0.076g四硼酸钠，1.6ml甲

醛(甲醛应放入冰箱中，易变性),加蒸馏水至400ml，现配现用。0.1%AgNO3：取0.1gAgNO3溶解于

100ml蒸馏水中，现配现用。

4.2仪器和用具

稻谷检验出糙机、电动研磨机、PCR扩增仪、电泳槽、电泳仪、照相机。

4.3照明要求

操作过程中照明条件应符合GB/T22505的要求。

4.4样品制备

纯合体杂草稻检测取样按GB5491-1985执行。上述纯合体杂草稻检测后，去除红色糙米，然后将

白色糙米按GB5491-1985中3.1的规定混匀。将样品倒在光滑平坦的桌面上或玻璃板上，用两块分样

板将样品摊成正方形，然后从样品左右两边铲起样品约10cm高，对准中心同时倒落，再换一个方向同

样操作(中心点不变)，如此反复混合4次～5次，将样品摊成等厚的正方形。取50份，每份200粒糙米。

5操作步骤

5.1纯合体杂草稻检测

使用稻谷检验出糙机脱壳，查看糙米的颜色，分别计数糙米总数（m）和红色糙米数（m1）。

5.2杂合体杂草稻检测

5.2.1磨粉

用电动研磨机将200粒白色糙米碾磨成粉，混合均匀，取4份，各30mg。

5.2.2DNA提取

采用适于提取水稻及其产品DNA的试剂盒方法，进行DNA提取。制备DNA模板时设置不加任何

试样的空白对照。

5.2.3DNA溶液纯度测定和保存

将DNA溶液适当稀释，测定并记录其在260nm和280nm的紫外光吸收率，OD260值应该在0.05～

1的区间内，OD260nm/OD280nm比值应介于1.4～2.0之间，根据OD260值计算DNA浓度。依据

测得的浓度将DNA溶液稀释到25ng/uL，-20℃保存备用。

5.2.4PCR反应和跑胶

见附录A。记录杂合条带的胶孔数（n）。

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6结果统计

6.1纯合体杂草稻检验结果计算

纯合体杂草稻含量（M）以质量分数（%）表示，按式（1）计算：

M=（m1/m）x100……(1)

式中：

m1-------糙米中红色糙米的粒数，单位为粒

m-------糙米的总粒数，单位为粒。

在重复性条件下，获得的四次独立测试结果，求其平均值，即为测试结果。测试结果保留到小数点后5

位。

6.2杂合体杂草稻检验结果计算

杂合体杂草稻含量（N）以质量分数（%）表示，按式（2）计算：

N=∑（n1/200）x100……(2)

式中：

n1-------杂合条带的胶孔数，单位为个。

在重复性条件下，获得的四次独立测试结果，求其平均值，即为测试结果。测试结果保留到小数点后5

位。

6.3杂草稻总混杂率检验结果计算

杂草稻总混杂率（T）以质量分数（%）表示，按式（3）计算：

T=M+NA……(3)

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BA

附录A

（规范性附录）

普通PCR方法

A.1引物

引物序列见表A.1，用TE缓冲液（pH8.0）或双蒸水分别将表A.1引物稀释到10µmol/L。

表A.1PCR引物序列

PCR产物大小

检测基因引物引物序列(5’-----3’)

(bp)

Primer1RED4-For:TTACAGGGGAGCAGAAACA

Rc118

Primer2RED4-Rev:TCTTCTCCTCTCTTTCAGCAC

Primer1RED4-For:TTACAGGGGAGCAGAAACA104

rc

Primer2RED4-Rev:TCTTCTCCTCTCTTTCAGCAC

A.2PCR检测

A.2.1PCR反应

A.2.1.1试样PCR反应

在PCR反应管中按表A.2依次加入反应试剂，轻轻混匀，再加约5μL石蜡油。10000rpm离心10s后，

将PCR管插入PCR仪中。反应程序为：94℃预变性5min;94℃变性45s,55℃退火45s,72℃延伸lmin,30

个循环;72℃延伸8min。反应结束后取出PCR反应管，对PCR反应产物进行电泳检测或在4℃下保存待

用。

表A.2PCR反应体系

成分体积(μl)

2×PCRMix4.0

ddH2O4.5

Primerforward(10μmol/L)0.25

Primerreverse(10μmol/L)0.25

模板DNA(10-20ng/μl)1

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注：2×PCRMix成分为dNTP0.2mmolL−1、KCl100mmolL−1、Tris-HCl(pH8.5)20mmolL−1、

TaqPolymerase5U/100μL、MgCl23.0mmolL−1。

A.2.1.2对照PCR反应

在试样PCR反应的同时，应设置阴性对照、阳性对照和空白对照。阴性对照是指水稻日本晴品种中

提取的DNA作为PCR反应体系的模板；阳性对照，用杂草稻作为PCR反应体系的模板；空白对照，用无

菌水空白对照作为PCR反应体系的模板。上述各对照PCR反应体系中，除模板外其余组分及PCR反应条

件与A.2.1.1相同。

A.2.2PCR产物电泳检测

A.2.2.16%聚丙烯酰胺凝胶的制作

a)制作底座：在桌面上铺上报纸，用于摆放制胶用长短板，在长短板左右分别夹上两片1mm厚薄

塑料片，用于间隔长短玻璃板，将胶灌入，用大夹子，用于固定玻璃板。按照1：100的比例配制琼脂糖

凝胶溶液，在微波炉中加热，沸腾2-3次至溶液澄清后倒入底座槽中，倒至槽子1/3处即可。将已摆放好

的长短制胶板（中间夹有薄塑料片）插入底座槽，用准备好的大夹子将其固定在制胶架上。虹吸作用会

使琼脂糖进入长短板之间，室温冷却后，即可把板子下端封闭。

b)6%聚丙烯酰胺凝胶配制：5×TBE5ml,40%丙烯酰胺3.75ml，去离子水16.25ml，混匀后加入

250ul10%过硫酸铵和12ulTEMED。搅拌后迅速进行灌胶。

c)灌胶：将混合液沿短板的一端慢慢灌入两板间的缝隙至上端开口处，再将胶孔梳插入两板之间，

加入少许混合液将缝隙完全灌满。注意灌胶过程中不可气泡，可以通过震荡板子将气泡赶出。

d)聚丙烯酰胺凝胶的凝固：室温下，聚丙烯酰胺凝胶经过15-20分钟将完全凝固，在此期间可以根

据液面的下降不时用剩余聚丙烯酰胺混合液补足。

e)聚丙烯酰胺凝胶板的安装：待凝胶彻底凝固后将板子拆下，放入盛有去离子水的盆中，利用水的

推力将胶孔梳取下，并剥离封口用的制胶槽和琼脂糖，在去离子水中清洗制胶板和加样孔，然后，将其

安装在加有1×TBE电泳缓冲液的电泳槽上，准备加样、电泳。

A.2.2.2电泳

吸取2µL的PCR产物与1ul加样缓冲液混合后加入点样孔中，在其中一个点样孔中加入1ul100bp

Marker，用于判断产物的长度。电泳时电压设置为120V，电泳时间设置为1小时。

A.2.2.3AgNO3银染与显色：

电泳后，采用银染方法对凝胶结果进行显色，具体步骤：电泳完成后，将胶板取下，用去离子水清

洗之后，轻轻撬开制