ELISA检测技术课件

ELISA檢測技術

ELISA技術

酶聯免疫吸附測定(Enzyme-linkedImmunosorbentAssay，ELISA)，是利用抗體分子能與抗原分子特異性結合的特點，將游離的雜蛋白和結合於固相載體的目的蛋白分離，並利用特殊的標記物對其定性或定量分析的一種檢測方法。ELISA技術的三個基本原理抗原或抗體能物理性地吸附於固相表面，並且保持其免疫活性；抗原或抗體能與酶通過共價鍵形成酶結合物，同時保持各自的免疫活性和酶活性；酶結合物與相應的抗原或抗體結合後，能通過加入底物的顏色反應來確定免疫反應的發生，顏色反應的深淺與標本中相應抗原或抗體的量成正比。ELISA的分類、原理和操作競爭法 原理：通過a組和b組顯色的差異，來確定標本中待測蛋白的量加酶標記抗原加底物顯色

優點：

1、待測抗原只需一個免疫結合位點，適合小分子抗原如激素和藥物之類；

2、操作步驟簡單快捷，只需一個保溫洗滌過程。

缺點：

1、酶標記抗體的用量大；

2、定量檢測的靈敏度和重複性存在不足。雙抗夾心法雙抗夾心法改良雙抗夾心法

優點：

1、待測抗原需要兩個或兩個以上的免疫結合位點，所以適合大分子抗原的檢測，一般在分子量5000D以上；

2、由於增加了一層抗體，提高了特異性檢測的靈敏度，尤其是改良的雙抗加心法；

3、重複性提高。

缺點：

1、操作複雜，費時費力。抑制性測定間接法測抗原

此方法操作簡單、迅捷但重複性一般較差；通常用於抗體效價的測定和某些疾病的早期診斷。ELISA的操作要點樣品的保存試劑的準備加樣固相載體包被洗滌封閉保溫顯色和比色樣本提取與保存

1）在5天內測定的血清標本可放置於4℃，超過一周測定的需-80℃冰存。

2）取約0.3-0.4g轉基因水稻樣品，加500-1000μlPBS緩衝液，用研缽磨碎，將研磨液轉入Eppendorf管中，10000rpm，4℃離心10min，取上清備用。

最佳取樣時間為水稻分蘖期，取樣時不同植株應取自同一部位的樣品；該樣品依所攜外源基因不同其存放時間不同；如BT水稻樣品可存放於-20℃三個月，-80℃半年以上。在提取樣品的過程中，裝入樣品研磨液的Bf管應置於冰浴中；上清應置於4℃，最多只能存放4天

試劑的準備

ELISA中用的蒸餾水或去離子水，包括用於洗滌的，應為新鮮的和高質量的；自配的緩衝液應用pH計測量較正；從冰箱中取出的試驗用試劑應待溫度與室溫平衡後使用；最好現配現用。ELISA的固相載體

最常用的是聚苯乙烯。聚苯乙烯具有較強的吸附蛋白質的性能。國際上標準的微量滴定板為8×12的96孔式。在實驗前，必須經紫外射線照射1~2小時後，其對免疫球蛋白的吸附性能增加

已包被抗原或抗體的固相載體在低溫（2-8℃）乾燥的條件下一般可保存6個月。包被的方式

定義：將抗原或抗體固定在固相載體的過程稱為包被，抗體和蛋白質抗原一般採用pH9.6的碳酸鹽緩衝液作為稀釋液，在ELISA板孔中加入包被液後，在4-8℃冰箱中放置過夜，37℃中保溫2小時被認為具有同等的包被效果包被的最適當濃度隨載體和包被物的性質及酶結合物的濃度協調選定。

加樣

在ELISA中一般有3次加樣步聚，即加標本，加酶結合物，加底物。加樣時應將所加物加在ELISA板孔的底部，避免加在孔壁上部，並注意不可濺出，不可產生氣泡。加標本一般定量多道加液器，使加液過程迅速完成。封閉

1）定義：是繼包被之後用高濃度的無關蛋白質溶液再包被的過程。

2）目的：抗原或抗體包被時所用的濃度較低，吸收後固相載體表面尚有未被佔據的空隙，封閉就是讓大量不相關的蛋白質充填這些空隙，從而排斥在ELISA其後的步驟中干擾物質的再吸附。

3）常用試劑：實驗室用的封閉劑是2%的牛血清白蛋白。包被好的ELISA板乾燥後放入密封袋或錫袋中，在低溫可保存數月。洗滌洗滌在ELISA過程中雖不是一個反應步驟，但卻也決定著實驗的成敗。聚苯乙烯等塑膠對蛋白質的吸附是普遍性的而在洗滌時可清除在反應過程中非特異性地吸附於固相載體的干擾物質洗滌時可清除殘留在板孔中沒能與固相抗原或抗體結合的物質洗滌方式（浸泡式）a.

甩幹孔內反應液；b.用洗滌液過洗一遍（將洗滌液注滿板孔後，即甩去）；c.浸泡，即將洗滌液注滿板孔，放置3分鐘，間歇搖動，浸泡時間不可隨意縮短；d.甩去液體後在吸水紙上拍幹；e.重複操作c和d，洗滌3次。保溫

1）在ELISA中抗原抗體反應的完成需要有一定的溫度和時間，這一保溫過程稱為溫育。

2）溫育常採用的溫度有43℃、37℃、室溫和4℃（冰箱溫度）等。

3）保溫時為避免蒸發，板上應加蓋，也可用塑膠貼封紙或保鮮膜覆蓋板孔。顯色和比色顯色是ELISA中的最後一步溫育反應，此時酶催化無色的底物生成有色的產物。在定量測定中，加入底物後的反應溫度和時間應按規定力求準確。定性測定的顯色時間一般不需要嚴格控制及時判斷。比色使用酶標比色儀在405nm波長讀數。若要終止反應，以防反應過度，常用的鹼性磷酸酶反應終止液為1MNaOH,每孔100ul。標準曲線建立樣品10μl+990μlPBSBradford法測定樣品中可溶性蛋白濃度100μl混合液+1000μlG-250紫外分光光度計、595nm依標準曲線測定測定值*100＝樣品總蛋白濃度用牛血清白蛋白（BSA）建立。分別配製5、10、15、20、30、50、80、100、140（μg•ml-1）的標準蛋白溶液（用PBS配製）系列。ELISA測定數據的處理

①根據標準Bt蛋白的量和