第六章 酶分子工程概述课件

第六章酶分子工程概述第六章酶的分子工程之一：概述第六章酶分子工程概述第一节酶的分子工程原因：1．稳定性不够，不能适应大量生产

的需要。2．作用的最适条件不符。3．酶的主要动力学性质的不适应。4．临床应用的特殊要求。5.。。。第六章酶分子工程概述酶的分子工程

——molecularengineeringoftheenzyme

主要指化学或分子生物学方法对酶分子进行改造

第六章酶分子工程概述洗衣粉:枯草芽孢杆菌蛋白酶加强去污能力，在漂白剂的作用下易失去活性。Met-222被氧化将酶蛋白分子中的氨基酸(Met-222)进行替代，使酶的抗氧化能力大大提高，因而可与漂白剂同时使用。第六章酶分子工程概述第六章酶分子工程概述分两部分：对天然酶分子进行改造，包括酶一级结构中氨基酸置换、肽链切割、氨基酸侧链修饰等分子生物学水平，即用基因工程方法对DNA或RNA进行分子改造，以获得化学结构更为合理的酶蛋白第六章酶分子工程概述1、化学酶工程又称为初级酶工程(Primaryenzymeengineering)，它主要由酶学与化学工程技术相互结合而形成，通过化学修饰、固定化处理、甚至通过化学合成法等手段，改善酶的性质以提高催化效率及降低成本。第六章酶分子工程概述它包括：自然酶化学修饰酶固定化酶化学人工酶等等的研究和应用。第六章酶分子工程概述2.生物酶工程：是酶学和以DNA重组技术为主的现代分子生物学技术相结合一门新兴的生物工程，亦称高级酶工程(AdvancedEnzymeEngineering)。第六章酶分子工程概述生物酶工程：克隆酶突变酶新酶第六章酶分子工程概述基因工程基本过程克隆酶第六章酶分子工程概述第六章酶分子工程概述20世纪90年代，随着基因工程的广泛介入，一些原来只能由动物或植物生产的酶，经过酶基因重组，可以在微生物上表达——摆脱对天然酶的依赖。“基因工程＋发酵工艺＋先进的发酵设备”

——酶工业的重大飞跃第六章酶分子工程概述最成功的例子：人纤维蛋白溶酶原激活剂促进溶解血块中的纤维蛋白。临床上用于治疗血栓性疾病，促进体内血栓的溶解。利用工程菌株生产的纤维蛋白溶酶原激活剂在疗效上与人体合成的酶完全一效，目前已用于临床试验。

凝乳蛋白酶生产乳酪的必需用酶，其来源有限。人们克隆了小牛凝乳酶基因在酵母系统中表达，得到的凝乳酶与从小牛胃中提取的天然酶性质完全一致。第六章酶分子工程概述突变酶第六章酶分子工程概述定向进化示意图随机突变+定向选择＝目标突变体细菌诱发突变的因素50

0C培养突变体库选择压力（温度）温度耐受型突变体最适生长温度为370C最适生长温度提高了！第六章酶分子工程概述超自然的优质酶新酶Thisimageshowsacomputer-generatedmodelforthedesignofanewenzymenotfoundinnature.Thisparticularproteindesign,calledretro-aldolase22,wastestedandwasabletoenhancetherateofacarbonbondbreakingchemicalreaction10,000timesovertherateoftheuncatalyzedreaction.

Beingabletobreakcarbonbondsmorequicklyandefficientlycouldleadtoimprovementsincleaninguporganicwasteandindevelopingrenewableenergysources

ImagesbyLinJiangandEricAlthoff,UniversityofWashingtonandHowardHughesMedicalInstitute.thedesignedactivesite(greymeshing)第六章酶分子工程概述第二节

酶蛋白的稳定性和稳定化第六章酶分子工程概述酶的稳定性

（enzymestability）是指酶分子抵抗各种不利因素影响，维持一定空间结构，保持生物活性相对稳定的能力。在细胞内，酶分子受到内膜系统保护，而且处于还原性环境，不易被氧化失活。而酶工程所涉及的催化过程几乎都在体外，条件比细胞内环境恶劣得多，酶不稳定的缺点显得尤其突出。第六章酶分子工程概述稳定的空间结构是酶催化活性稳定的基础从分子水平上看一级结构：肽键和二硫键。酶分子空间结构通常比一级结构更为脆弱，非共价键包括疏水键、氢键、离子键、范德华力、金属离子结合等。一、蛋白质稳定性的分子原因第六章酶分子工程概述蛋白质稳定性的分子原因：A:金属离子、底物、辅助因子和其他相对分子质量配体的结合作用第六章酶分子工程概述金属离子由于结合到多肽链的不稳定部分（特别是弯曲处），因而可以显著增加蛋白质的稳定性。当酶与底物、辅因子和其它低分子量配体相互作用时，也会看到蛋白质稳定性的增加。这是因为蛋白质与上述效应子的作用常使蛋白质发生构象变化，使其构象更稳定。第六章酶分子工程概述B:蛋白质-蛋白质和蛋白质-脂的作用当蛋白质形成复合物时，脂分子或蛋白质分子稳定到疏水簇上，因而防止疏水簇与溶剂的接触，屏蔽了蛋白质表面的疏水区域第六章酶分子工程概述在体内，蛋白质常与脂类或多糖相互作用，形成复合物，从而显著增加蛋白质稳定性。这是因为蛋白质分子表面上既有疏水簇，也有极性和带电基团。从热力学上看，疏水簇与水的接触对蛋白质稳定性是不利的。当蛋白质形成复合物时，脂分子或蛋白质分子稳定到疏水簇上，因而防止疏水簇与溶剂的接触，屏蔽了蛋白质表面的疏水区域第六章酶分子工程概述C:盐键和氢键数目较少，但对蛋白质稳定性贡献很显著目前认为：氢键与蛋白质稳定性关系不大3-磷酸-甘油醛脱氢酶：

来源：嗜热脂肪芽孢杆菌兔肌

结构很类似，但嗜热的酶亚基间区域有盐桥协作系统，而嗜温的酶没有。

因此嗜热酶的催化活力的变性温度和最适温度都比嗜温酶高出约20℃。第六章酶分子工程概述D：二硫键Disulfidebond大分子的分子内交联可增强其坚实性，并提高其在溶液中的稳定性

在酶分子中引入-SH，或者，用双功能试剂实现分子内交联，也能使蛋白质构象稳定化第六章酶分子工程概述引入二硫键研究发现，在酶蛋白中引入半胱氨酸，从而增加酶蛋白中二硫键的数量可以增加某些酶的稳定性，但不影响酶的活性。Tumnen等报道将Trichodermareesei的木聚糖酶II的一个α-螺旋中的Ser-110和Asp-154分别突变为Cys，从而在110位和154位建立一个二硫键，65℃时的半衰期从不到1min增加到14min。Wakarchuk等在木聚糖酶分子中引入不影响其活性的二硫键，使其耐热性提高了15℃。第六章酶分子工程概述用二硫键稳定蛋白质的思想来自于聚合物化学。五十年代中期已经证明，大分子的分子内交联可增强其坚实性，并提高其在溶液中的稳定性。稳定化指的是熵性质：由于交联即蛋白质中形成二硫键，伸展蛋白质的熵急剧降低，因而天然蛋白和变性蛋白的自由能间的差别增加。这个稳定化效应值随着肽链中氨基酸数目的增加而增加。类似的，用双功能试剂实现分子内交联，也能使蛋白质构象稳定化，这点我们在后面还会提到。第六章酶分子工程概述E：疏水相互作用对蛋白质的稳定性非常重要增加疏水作用数目是稳定蛋白质的实用方法。降低蛋白质表面的疏水性质；增加蛋白质内部的疏水性。从实验上看，可用定点突变或化学修饰来实现这个目的。第六章酶分子工程概述F：对氧化修饰敏感的氨基酸含量较低结构上重要的氨基酸残基（如活性部位氨基酸）的氧化作用是蛋白质失活的最常见的机理之一。半胱氨酸的巯基和色氨酸的吲哚环，对氧化特别敏感因此，这些不稳定氨基酸的数目，在高度稳定的嗜热蛋白质中比在相应的嗜温蛋白质中显著偏低第六章酶分子工程概述MAPK磷酸酶（MPKs）削弱应激激活的MAPK信号传递。MPK含有一个半胱氨酸巯基（sulfhydrylgroup），决定其催化活性。如果该基团在活性氧簇（reactiveoxygenspecies，ROS）下发生氧化，MPK活性不可逆地消失第六章酶分子工程概述G：氨基酸残基的坚实装配蛋白质结构中仍有空隙,通常为水分子所充满。分子量为2―3万的蛋白质中约有个5―15水分子，会导致蛋白质不稳定。因此，蛋白质的坚实化可作为一种人为稳定蛋白质的方法第六章酶分子工程概述溶液中的蛋白质似乎装配紧密，其紧密程度类似于低分子量化合物的晶体状态。尽管如此，蛋白质结构中仍有空隙。按照Chothia说法，蛋白球体积的大约25%仍未充满，即不是被氨基酸占据。但溶质分子可以包埋在这些孔隙中。这些孔隙通常为水分子所充满。由布朗运动调节的极性水分子与球体疏水核的接触当然会导致蛋白质不稳定。随着水分子从孔隙中除去，蛋白质结构变得更坚实，蛋白质的稳定性也增加。因此，蛋白质的坚实化可作为一种人为稳定蛋白质的方法。第六章酶分子工程概述蛋白质稳定性因素金属离子、底物、辅因子和其它低分子质量配体的结合使蛋白质构象稳定；蛋白质与其它的生物大分子尤其是蛋白质与脂的作用；盐键

；疏水相互作用；氢键；二硫键；对氧化修饰敏感的氨基酸含量降低；氨基酸残基的坚实装配。第六章酶分子工程概述二、蛋白质不可逆失活的原理和机理第六章酶分子工程概述酶在使用和贮存过程中的失活常是由于微生物和外源蛋白水解酶作用的结果。蛋白水解酶可催化肽键水解。当蛋白质底物也是一种蛋白水解酶时，就会发生自我降解现象，叫作自溶

1.蛋白水解酶和自溶作用

第六章酶分子工程概述2.聚合作用聚合很久以来就被认为是蛋白质失活的一种机理。首先，单分子（N）构象变化，导致蛋白质可逆变性(U)。使包埋的疏水性氨基酸残基暴露于水溶剂。其次，这种三级结构改变了的蛋白质分子彼此缔合（A），以最大限度地减少疏水氨基酸残基的不利的裸露。最后，如果蛋白质当中含cys，形成二硫键（As）当然，聚合作用不一定是不可逆的：用变性剂破坏非共价力（氢键或疏水键）还原或氧化再生二硫键，可使蛋白质活化。NUAAs第六章酶分子工程概述聚合很久以来就被认为是蛋白质失活的一种机理。大约100年前，科学家就发现，加热蛋白水溶液会形成沉淀。聚合分三步进行：N≒U→A→As其中N≒U代表可逆伸展，A是聚合的蛋白质，As是发生了二硫交换反应的蛋白质聚合物。首先，必须发生单分子构象变化，导致蛋白质可逆变性。这个过程使包埋的疏水性氨基酸残基暴露于水溶剂。其次，这种三级结构改变了的蛋白质分子彼此缔合，以最大限度地减少疏水氨基酸残基的不利的裸露。最后，如果蛋白质分子含有半胱氨酸和胱氨酸残基，则会发生分子间二硫交换反应。与许多其它蛋白质失活原因不同，聚合并不一定是不可逆的。使用变性剂破坏分子间的非共价力（氢键或疏水相互作用），在去除变性剂时，通过还原和再氧化再生天然二硫键，则有可能使蛋白质再活化。第六章酶分子工程概述注意：聚合和简单的沉淀作用是有区别的。简单的沉淀：蛋白质并未发生显著的构象变化即从溶液中析出。因此，沉淀很易再溶于水溶液中，并恢复其全部天然特性，就象结晶蛋白和冻干蛋白质那样。第六章酶分子工程概述3.极端pH极端pH能启动改变、交联或破坏氨基酸残基的化学反应，结果引起不可逆失活。远离蛋白质的等电点，蛋白质分子内相同电荷间的静电斥力会导致蛋白质伸展。但这些构象变化常能导致不可逆聚合；对蛋白酶来说，常导致自溶第六章酶分子工程概述肽键水解也容易在强酸条件下或中等pH和高温相结合的条件下发生。6mol/LHCl，24h,110℃：蛋白质可完全水解成氨基酸。在Asp所处的肽键在不太酸的环境下短时间也易水解（尤其是Asp-Pro）。Asn和Gln的脱胺作用，会导致蛋白质的疏水性内部引进入负电荷，使得酶失活第六章酶分子工程概述食品加工时，蛋白质一般要暴露于碱性条件，发生各种各样的反应，其中包括肽键水解、脱胺、精氨酸水解成鸟氨酸、β-消除和外消旋化、双键形成、氨基酸残基破坏和形成新的氨基酸。第六章酶分子工程概述4.氧化作用各种氧化剂能氧化带芳香族侧链的氨基酸以及蛋氨酸、半胱氨酸和胱氨酸残基。分子氧，H2O2和氧自由基是常见的蛋白质氧化剂。第六章酶分子工程概述H2O2是非专一性氧化剂。在酸性条件下，它主要把蛋氨酸氧化成它的亚砜。虽然蛋氨酸亚砜在体内可被酶、在体外可被巯基化合物还原，但这个反应限制了酶在工业上的应用和贮存。在生物系统中，蛋白质的氧化失活是通过活性氧（·OH、O2¯、H2O2、OCI-）来完成的。例如，中性白细胞可以产生高浓度的氧化剂杀死细菌。第六章酶分子工程概述5.表面活性剂和去污剂去污剂有离子性和非离子性两大类，都含有长链疏水尾巴，但“头”部基团不同，有带电的，有不带电的。去污剂的亲水部分和疏水部分之间的相对平衡是决定其行为的重要因素第六章酶分子工程概述对于几乎所有的蛋白质来说，每克蛋白质结合SDS的最大量类似，大约1.4g/g。SDS-多肽复合物本质上是胶团，SDS分子聚集在蛋白质暴露的疏水区域周围。第六章酶分子工程概述6.变性剂脲和盐酸胍高浓度盐螯合有机溶剂第六章酶分子工程概述脲和盐酸胍高浓度脲（8-10mol/L）和盐酸胍（GdmC,6mol/L）常用于蛋白质变性，作用机理不明确，可能：消除了在维持蛋白质三级结构中起重要作用的疏水相互作用。直接与蛋白质分子作用。第六章酶分子工程概述应当特别注意的是，由脲可自发形成氰酸盐。8mol/L脲溶液平衡时大约含有0.02mol/L氰酸盐。氰酸盐可与蛋白质中的氨基和巯基相互作用，引起不可逆失活。因此，脲溶液应在用前用优质固体脲新鲜配制。第六章酶分子工程概述高浓度盐

高浓度盐对蛋白质既可有稳定作用，也可有变性作用，这要看盐的性质和浓度，(CH3)4N+>NH4+>K+,Na+>Mg2+>Ca2+>Ba2+>SO42->CI->Br->NO3->CIO4->SCN-越靠近序列左侧的离子对蛋白质的稳定作用越强，愈靠近该序列右边的离子越使蛋白质不稳定。例如，(NH4)2SO4是酶稳定剂，贮存酶时常用它。

NaSCN（硫氰酸钠）是酶的紊乱剂第六章酶分子工程概述越靠近序列左侧的离子对蛋白质的稳定作用越强，因为它们能通过增加溶液的离子强度，降低蛋白质分子上疏水基团的溶解度。此外，这些盐能增加蛋白质周围的水簇，引起系统总自由能损失（水的熵降低）。这两种效应结合起来，通过盐析疏水基团，使蛋白质分子更坚实，结果使蛋白质稳定。愈靠近该序列右边的离子越使蛋白质不稳定。这些离子能结合于蛋白质的带电基团或结合于肽键的偶极子，结果降低蛋白质周围的水簇数目。这种作用引起蛋白质盐溶，降低蛋白质构象稳定性。第六章酶分子工程概述螯合结合金属离子的试剂,如EDTA能使金属酶失活这类失活常常是不可逆的，相反，螯合剂通常可以稳定不需要金属离子的蛋白质第六章酶分子工程概述

酶既可在水溶液中发挥作用，也可在无水有机溶剂中发挥作用。但当与水混溶的有机溶剂加入蛋白质水溶液中时，则可看到酶失活。这是因为有机溶剂通过疏水相互作用直接结合于蛋白质，并改变溶液的介电常数。后者影响维持蛋白质天然构象的非共价力的平衡。因此，有机溶剂通过增加疏水核的溶解度，降低带电表面的溶解度而具有使蛋白质“从里往外翻”的倾向。另一方面，蛋白质（酶）要在几乎无水的环境中发挥作用，必须在其分子表面有一单层必需水来维持它的活性构象，而与水混溶的有机溶剂能夺去酶分子表面的必需水，因而使酶失活。第六章酶分子工程概述7.重金属离子和巯基试剂已知重金属阳离子，如Hg2+，Cd2+，Pb2+能与蛋白质的巯基反应（将其转化为硫醇盐），也能与组氨酸和色氨酸残基反应。此外，银或汞能催化水解二硫键巯基试剂通过还原二硫键也能使酶失活，但这个作用常是可逆的。第六章酶分子工程概述8.热热失活是最经常遇到的蛋白质失活工业上的酶法加工大多要求在较高温度下进行，因为这可以增加溶解度和反应速度以及降低溶液粘度、防止微生物污染。所以热失活是工业上最经常遇到的酶失活的原因。第六章酶分子工程概述热失活通常也是两步过程：酶可逆热伸展使它的反应基团和疏水区域暴露，随后相互作用导致不可逆失活。有两种构象过程能引起不可逆热失活。第一，由于热伸展，包埋的疏水区域一旦暴露于溶剂，则会发生蛋白质聚合。第二，单分子构象扰动能引起酶失活。高温下，酶丧失其常规的非共价相互作用，但当恢复常规条件时，在被扰动的酶分子结构中形成非天然的非共价相互作用，虽然这种结构从热力学上说不如天然构象稳定，但由于纯动力学原因还能保存下来，因为多肽链的分子运动随温度降低而下降。高温引起蛋白质一级结构的改变：高温（90-100℃）下，依赖pH的共价反应限制了酶的热稳定性。这些反应包括：Asn和Gln的脱胺作用，在Asp处的肽键水解，Cys的氧化，二硫交换作用和二硫键的破坏。上述这些破坏性反应直接导致高温下酶失活。此外，若系统中有还原糖（如葡萄糖），糖很易与Lys的ε-氨基作用，这叫“Maillard反应”，是食品工业中热失活的原因。第六章酶分子工程概述9.机械力压力、剪切力、振动超声第六章酶分子工程概述1).振动振动使蛋白质失活的机理是，振动增加气-液界面的面积。蛋白分子在这个界面上呈线性排列并伸展，以使疏水残基最大限度地暴露于空气。然后，蛋白质由于疏水区域的暴露而聚合。第六章酶分子工程概述2).剪切

当酶溶液快速通过管道或膜时，则在管（膜）壁处或靠近管（膜）壁处产生剪切力梯度。这个梯度能引起蛋白质构象变化，导致原先埋藏的疏水区域暴露，然后聚合。失活程度随剪切速度的增大和暴露时间的增长而增加。第六章酶分子工程概述3).超声波

超声波压力使溶解的气体产生小气泡，小气泡迅速膨胀至一定程度时突然破碎，这就是空化作用，它既产生机械力，又产生化学变性剂（如在小气泡中热反应所产生的自由基），结果使蛋白质失活。第六章酶分子工程概述4).压力0.1-6×108pa的压力下可使酶失活。压力诱导的失活通常认为是蛋白质变性后聚合的结果，但还有另外两个失活机理：第一，已经证明，多亚基酶在高压下可解离成单体，取消压力后，活力得到不同程度的恢复，但很多这类失活是不可逆的。第二，关于乳酸脱氢酶的工作表明，半胱氨酸氧化与失活机理有关，而这个反应与压力引起的酶结构变化有关。第六章酶分子工程概述10.冷冻和脱水低温减弱疏水作用，引起蛋白质的解离和变性溶质（酶和盐）随着水分子的结晶而被浓缩，引起酶微环境中的pH和离子强度的剧烈改变。磷酸盐缓冲液的pH在冷冻后可由7变到3.5，离子强度提高，引起寡聚蛋白质的解离。第六章酶分子工程概述二硫交换或巯基氧化。酶浓度增加引起Cys浓度也增加。分子内和分子间的二硫交换反应就很容易发生，巯基在低温下更易氧化，因为在-3℃部分冻结系统内的氧浓度要比0℃溶液中的高1150倍。这种浓缩效应还能增加氧自由基的浓度。第六章酶分子工程概述11.辐射作用电离辐射：如γ射线，X射线，电子，α粒子等直接作用由于形成自由基而引起一级结构的共价改变，继而交联或氨基酸破坏。这导致天然构象丧失或聚合。间接作用是由于在水溶液中形成反应性产物，其中主要是·OH自由基，溶解的电子和H2O2等。第六章酶分子工程概述蛋白质失活既可由直接作用（辐射对蛋白质分子的影响）引起，也可由间接作用（水辐射分解副产物对蛋白质分子的影响）引起。第六章酶分子工程概述非电离辐射，如可见光，紫外线等可见光的光化学氧化要求光敏化染料，它能吸收光能，然后氧化蛋白分子中的敏感基团（半胱氨基，色氨酸，组氨酸）。UV辐射能直接破坏蛋白质的氨基酸而使蛋白质失活；胱氨酸和色氨酸残基特别不稳定。第六章酶分子工程概述失活机理变性条件聚合（有时伴随形成分子间二硫键）加热，变性剂脲，盐酸胍,SDS,振动一级结构改变1、酸、碱催化的肽键水解，蛋白水解和自溶作用极端pH值，加热，蛋白水解酶2、功能基氧化（半胱氨酸巯基和色氨酸吲哚环）氧气、氧气代谢产物，辐射3、二硫键还原，分子间二硫交换加热，高pH，巯基化合物,二硫化物4、必需巯基的化学修饰金属离子，二硫化物5、蛋白质磷酸化蛋白激酶6、在催化过程中由于反应中间物（主要是自由基）引起的“自杀”失活底物7、氨基酸的外消旋化加热，极端pH8、二硫键剪切后形成新氨基酸加热，高pH9、天冬酰胺脱胺加热，高PH辅酶分子从活性部位上解离螯合剂、透析、加热，金属离子寡聚蛋白解离成亚基化学修饰，极端pH,脲，表面活性剂，高温或低温吸附到容器表面蛋白质浓度低,加热“不可逆”构象改变加热，极端pH,有机溶剂,盐酸胍流体中的剪切失活流体形变第六章酶分子工程概述三、蛋白质的稳定化酶分子的可逆伸展（不可逆失活的初始阶段）黑体部分是酶的活性中心第六章酶分子工程概述当酶暴露于一定浓度的变性剂或不利的环境条件时，这些非共价力先减弱，后破坏，引起酶分子至少部分伸展。伸展的结果损坏了酶的活性部位，引起酶失活这个伸展过程是完全可逆的。一旦除掉不利的条件，酶分子能重新折叠成它的催化活性形式，因为这种构象从热力学上说是有利的。事实上，天然态和伸展态的自由能的净差值是5-20Kcal/mol，此值只相当于几个额外的氢键或离子键的贡献。第六章酶分子工程概述酶的不可逆失活示意图第六章酶分子工程概述解决问题要从两方面着手：一是如何防止酶的可逆伸展，二是一旦酶发生可逆伸展，那么如何防止其不可逆失活反应发生。第六章酶分子工程概述对于防止酶可逆伸展，可以开发出普遍适用的方法，但对酶不可逆失活，由于原因复杂，还得需要一些特殊的稳定化方法第六章酶分子工程概述稳定天然酶的方法方法说明固定化1、酶多点连接于载体上酶构象坚固化；立体障碍防止蛋白水解酶的降解作用2、分配效应和扩散限制载体的化学和物理性质影响酶分子周围的微环境非共价修饰1、添加剂专一性添加剂使N≒U平衡向N移动；竞争性添加剂除掉破坏性催化剂；有的中性盐和多羟基化合物的保护作用2、反相胶团反相胶团中酶抵抗有机溶剂变性3、蛋白质间相互作用酶的抗体保护酶化学修饰1、共价交联使酶构象坚固化2、改变离子状态或引入立体障碍的试剂修饰增加、中和或改变酶分子上的带电残基；可溶性大分子的连结抑制与其它溶质（蛋白酶）的相互作用蛋白质工程定点突变取代不稳定的氨基酸残基，引入稳定酶的因素第六章酶分子工程概述1.固定化：（A）交联（B）共价连接或吸附（C）包埋可以使酶构象更加坚牢，从而阻止酶构象从折叠态向伸展态过渡,并可抑制酶的自降解

第六章酶分子工程概述2、非共价修饰1)．反相胶团（束）第六章酶分子工程概述

所谓反胶团,是指当油相中表面活性剂的浓度超过临界胶束浓度后,其分子在非极性溶剂中自发形成的亲水基向内、疏水基向外的具有极性内核的多分子聚集体第六章酶分子工程概述随着表面活性剂在水中浓度的增大,水相表面张力降低得很快,当表面活性剂量达到某个定值(称为临界胶束浓度)后,溶液中形成了由50个~100个乳化剂分子组成的聚集体,称为胶束用适当的口袋包埋酶或使酶微囊化，可使酶在不利环境下有效地起作用。反相胶团最易提供这种微囊化。反相胶团是由两性化合物在占优势的有机相中形成的第六章酶分子工程概述蔗糖酶

包埋在由SDS和苯等组成的反相胶团中的的活力比其在水介质中的活力高4倍多，而且维持活力的时间由48h延长至7天。视溶剂和表面活性剂的组成，可在与水不混溶的溶剂中得到微乳化的反相胶团。反相胶团不仅可以保护酶，还能提高酶活力，改变酶的专一性。第六章酶分子工程概述事实上，在保证酶有效作用所必需的水量的前提下，酶在有机溶剂中的稳定性比在水中更好。例如，在干燥的三丁酸甘油酯中的脂肪酶相当稳定，100℃时的半寿期大于12h,而水含量大于1%时，酶立即失活。这主要是由于酶在无水有机溶剂中的构象高度坚实化，有机溶剂“冻结”了酶的活化构象。另外一个原因是缺乏游离水，而实验证明，酶的任何一个失活过程都需要水的参与。第六章酶分子工程概述2)．添加剂：可增加溶液酶或冻干过程中酶的稳定性

添加剂不仅可以提高酶的热稳定性，还可提高酶抗蛋白水解、抗化学试剂、抗pH变化、抗变性剂、抗稀释作用等的稳定性。专一性的底物和配体；非专一性的中性盐和多羟基化合物（如甘油、糖和聚乙二醇）；与酶失活剂竞争的物质或除掉破坏化学反应催化剂的物质，如加入的蛋白质，螯合剂和还原剂。第六章酶分子工程概述专一性的底物和配体酶反应的底物或产物、变构效应剂、辅酶或辅酶衍生物能与酶紧密结合，因而使天然酶≒伸展酶之间的平衡向天然酶方向移动，从而对酶的总活力产生有益的影响。如果酶与底物结合，则得到低内能构象，产生的复合物能更好地抵抗变性作用。如果专一性配体不是酶底物，原因可能是由于酶-配体相互作用，也可能是由于酶微环境的修饰。第六章酶分子工程概述甘油、糖和聚乙二醇是多羟基化合物，能形成很多氢键，并有助于形成“溶剂层”，这种酶分子周围的溶剂层与整体水相不同。它们可增加表面张力和溶液粘度。这类添加剂通过对蛋白质的有效脱水，降低蛋白水解作用而起稳定酶的作用。Gekko用低分子量多元醇稳定了溶菌酶，发现变性温度随多元醇的浓度和多元醇上羟甲基