生物样品的处理方法

第五章药物定量分析与分析方法验证第五章药物定量分析与分析方法验证第一节定量分析样品的前处理方法第二节定量分析方法的特点第三节药品分析方法的验证第四节生物样品分析方法的基本要求第五章药物定量分析与分析方法验证

生物样品分析的特点1．干扰物质多——生物样品中含有大量的内源性物，如质蛋白质、脂肪等，以及代谢物、结合物等干扰分析

——样品一般均需经过分离、净化后才能进行分析2．样品量少、不能重复取样——生物样品多数在特定条件下采集，无法再次取样 3．被测成分浓度低——对分析方法的灵敏度及专属性要求较高第五章药物定量分析与分析方法验证1.检测方法的高灵敏度—最低检测量10-9~10-7g或10-15~10-12g2.分离方法的高选择性、高专属性 为满足各项要求，最常用的分析方法有

1）色谱法——GC、HPLC、HPCE（high-performancecapillaryelectrophoresis）

2）免疫分析法——RIA、EIA 3）联用技术——GC-MS、LC-MS体内分析方法要求（1）去除蛋白质(血样)①加与水混溶的有机溶剂—蛋白质分子内和分子间氢键发生改变.(乙腈、甲醇、丙酮、四氢呋喃)②加中性盐—蛋白质脱水.(饱和硫酸铵、硫酸钠、镁盐、磷酸盐及枸橼酸盐等)③加强酸—与蛋白质阳离子形成不溶性盐沉淀(

10%三氯醋酸、6%高氯酸、5%偏磷酸等)④加含锌盐及铜盐的沉淀剂—与蛋白质阴离子形成不溶性盐沉淀.(CuSO4-Na2WO4、ZnSO4-NaOH)⑤酶解法—枯草菌溶素.适用于酸不稳定及蛋白结合牢固药物.第五章药物定量分析与分析方法验证-样品前处理生物样品的处理方法（2）缀合物的水解(尿样)含羟基、羧基、氨基和巯基药物

+葡萄糖醛酸→葡萄糖醛酸苷缀合物含酚羟基、芳胺和醇类药物

+硫酸→硫酸酯缀合物第五章药物定量分析与分析方法验证-样品前处理生物样品的处理方法常用方法:酸水解:盐酸酶水解:葡萄糖醛酸苷酶硫酸酯酶葡萄糖醛酸苷酶-硫酸酯酶

第五章药物定量分析与分析方法验证-样品前处理生物样品的处理方法（3）分离纯化与富集①液-液萃取法水相pH值是萃取成功的关键水相最佳pH值碱性药物：高于pKa值1

2个pH单位 酸性药物：低于pKa值1

2个pH单位第五章药物定量分析与分析方法验证-样品前处理生物样品的处理方法

但生物样品宜在碱性或近中性提取——生物基质中内源性物质多为酸性，在碱性下不易萃取

空白血清在pH2、pH7和pH13缓冲液中乙醚提取，提取液用RP-HPLC(UV)测定，碱性(pH13)下提取液的杂质峰最少第五章药物定量分析与分析方法验证-样品前处理生物样品的处理方法空白血清乙醚提取物的HPLC色谱图第五章药物定量分析与分析方法验证-样品前处理生物样品的处理方法②液-固提取法（固相萃取法）

原理：将不同填料作为固定相装入微型小柱，当含有药物的生物样品溶液通过时，由于受到吸附、分配、离子交换或其它亲和力作用，药物或杂质被保留在固定相上，用适当溶剂清洗杂质，再用适当溶剂洗脱药物。第五章药物定量分析与分析方法验证-样品前处理生物样品的处理方法(4)化学衍生化

化学衍生化目的①使药物变成具有能被分离的特性②提高对样品的检则灵敏度③增加药物的稳定性④提高对光学异构体的分离能力第五章药物定量分析与分析方法验证-样品前处理生物样品的处理方法

（5）有机破坏方法：湿法破坏干法破坏氧瓶燃烧法第五章药物定量分析与分析方法验证-样品前处理生物样品的处理方法

湿法破坏常用试剂：硝酸或硝酸-高氯酸.特点：破坏能力强、反应激烈，无机金属离子为高价态.应用：适用于血、尿、组织等生物样品的破坏.

第五章药物定量分析与分析方法验证-样品前处理生物样品的处理方法高温炉高温破坏应用——适合人发样品的破坏干法破坏第五章药物定量分析与分析方法验证-样品前处理生物样品的处理方法氧瓶燃烧法应用——血浆、人发中卤素、硫、硒等血浆：血浆1ml分次点于无灰滤纸上60℃烘干,按规定折叠后固定.人发：洗净、干燥（60℃~80℃）剪碎,

称取0.1~0.3g置无灰滤纸,按规定折叠固定.生物样品的处理方法第五章药物定量分析与分析方法验证-样品前处理第五章药物定量分析与分析方法验证生物样品定量分析方法验证内容与基本要求 1．特异性——避免干扰

2．标准曲线与线性范围——覆盖所有浓度范围

3．准确度——与实际状况相符

4．精密度——结果可重现

5．定量限——达到峰浓度的1/10～1/20 6．稳定性——确保所有样品准确测定

7．提取回收率——确保准确度18一、方法特异性

方法的特异性(specificity) ——又称专属性或专一性，通常与选择性(selectivity)互用

——系指当有内源性物质存在时，方法准确测定待测物质的能力 专属性——表示所检测的信号(响应)系属于待测药物所特有的 选择性——系指将待测物质与其代谢物及同服的其它药物加以区分(分离)的能力

特异性——涵盖二者，以验证所测定的物质与待测药物的同一性 考察一个分析方法是否具有特异性。第五章药物定量分析与分析方法验证19二、标准曲线与线性范围

标准曲线（standardcurve）——calibrationcurveorworkingcurve ——生物样品中所测定药物浓度与响应的相关性（比例的程度）

——通常用回归分析方法所得的回归方程来评价

——除少数方法（免疫分析法）外，标准曲线通常为线性模式

——回归分析法为最小二乘法（leastsquares） 或加权最小二乘法（weightedleastsquares）

线性范围（linearrang）——标准曲线的最高与最低浓度的区间

——模拟生物样品的测定结果应达到试验要求的精密度和准确度第五章药物定量分析与分析方法验证20二、标准曲线与线性范围(续)

标准曲线——用模拟生物样品建立 线性范围(不包括零点)应能覆盖全部生物样品中的药物浓度 不能使用外推的方法求算未知生物样品中的药物浓度

建立标准曲线所使用的模拟生物样品 应使用与待测的含药生物样品相同的生物基质制备第五章药物定量分析与分析方法验证21标准曲线的限度要求

药代动力学或生物利用度研究

——标准曲线至少包括5个浓度(通常为5～8个浓度,不包括零点)

——最高浓度应高于达峰浓度(Cmax)；最低浓度应低于Cmax的10%～5%，并应为方法的LOQ(非LOD) ——回归方程的截距应接近于零

——相关系数要求

≥0.99(色谱法)或≥0.98(生物学方法) ——若非线性，可分为高低两个浓度区间(每个区间不少于5个浓度)，分别加权回归——如1、2、5、10、20和10、20、50、100、200第五章药物定量分析与分析方法验证22三、准确度

方法准确度(accuracy) ——系指用该方法测得的生物样品中待测药物的浓度与其真实浓度的接近程度

——应使用实际生物样品测定，但实际生物样品的浓度是未知的所以，通常使用模拟生物样品测定

——一般用相对回收率(relativerecovery，RR)或相对误差(relativeerror，RE)表示第五章药物定量分析与分析方法验证231.测定法

取空白生物基质（如血浆）数份，照标准曲线项下方法操作，用标准曲线计算 在标准曲线范围内制备质控(qualitycontrol，QC)样品

——高(接近上限)、中、低(接近LOQ)3个浓度

——每一浓度至少5个样本

——与随行的标准曲线同法测定、计算，每个样品分析测定1次第五章药物定量分析与分析方法验证242.结果计算与限度要求

计算

——测定值M(measured)平均值与理论浓度(加入值)A(added)比值 相对回收率 相对误差 限度要求

——相对回收率应在85%～115%(LOQ附近80%～120%) ——RE在±15%(LOQ附近为±20%)第五章药物定量分析与分析方法验证2025/1/11体内药物分析25四、精密度

方法精密度(precision) ——系指每次测定结果与多次测定的平均值的偏离程度

——表示该分析方法的可重复性(reproducibility) ——反映分析方法的可操作性，是方法验证的基本要点之一 实际生物样品的量有限(如血浆，一般为0.5～2ml) ——使用模拟生物样品测定第五章药物定量分析与分析方法验证261.表示方法

方法精密度一般用标准偏差(standarddeviation，SD)或相对标准偏差(relativestandarddeviation，RSD)表示

SD= RSD= = ——包括批内(within-run或intra-assay)RSD—日内(within-day)

批间(between-run或inter-assay)RSD—日间(between-day，day-to-day)第五章药物定量分析与分析方法验证272.测定法——分别测定法(Ⅰ)

照准确度项下方法，取空白生物基质(如血浆)数份，分别在同一批内和不同批间制备高、中、低3个浓度的QC样品，并分析测定

批内RSD ——每一浓度5～6个样品，每个样品测定1次，用随行标准曲线分别计算3个浓度及每1浓度的RSD

批间RSD ——每1分析批内每一浓度制备1个样品，每个样品测定1次；用随行标准曲线计算3个浓度(每一浓度5～6个分析批数据)的RSD第五章药物定量分析与分析方法验证282.测定法——连续测定法(Ⅱ)

若实际样品测定所用的分析批次少于5批，也可进行3个批次的连续分析(每1浓度的每1批次为5～6个样本)——方差分析法

批间RSD=

批内RSD= =第五章药物定量分析与分析方法验证2025/1/11体内药物分析293.限度要求

在药代动力学和生物利用度研究中 对

g/ml级水平的RSD一般应≤10%

ng/ml级水平的RSD一般应≤15%

在LOQ附近RSD应≤20%。第五章药物定量分析与分析方法验证30五、定量限

方法定量限(limitofquantitation，LOQ) ——系指在保证具有一定可靠性(准确度与精密度符合要求)的前提下，能测定出生物样品中药物的最低浓度

——又称为方法灵敏度(sensitivity) ——标准曲线上的最低浓度点(最低浓度点≥LOQ)

要求

——应能满足测定3～5个消除半衰期后生物样品中的药物浓度

——准确度在80%～120%(或RE在±20%的范围内) ——RSD＜20%第五章药物定量分析与分析方法验证31六、稳定性与质量控制

稳定性——包括方法稳定性和样品稳定性

方法稳定性——方法的耐用性

样品稳定性——生物样品的存放条件和时间、冻-融循环

测定法——QC样品穿插于实际样品测定全过程

——模拟(或实际)生物样品及其预处理后的待测溶液进行考察

要求

——准确度85%～115%(RE在±15%范围内)，RSD＜15%第五章药物定量分析与分析方法验证32七、提取回收率

生物样品的预处理方法

——重点考虑方法准确度(或相对回收率)，操作简便、快速

——提取回收率(绝对回收率，absoluterecovery)，≥70%

萃取回收率与相对回收率的意义不同 提取回收率——考察生物样品预处理过程造成的药物的程度损失 相对回收率——采用标准曲线可准确计算生物样品中药物浓度第五章药物定量分析与分析方法验证331.测定法

取空白生物基质(如血浆)，照准确度项下方法，制备高、中、低3个浓度的QC样品(每一浓度至少5个样品)，每个样品分析测定1次 另取等量的相同3个浓度的标准溶液，用溶解模拟生物样品经提取处理后的残渣的溶剂稀释至同体积，同法测定

AT——经萃取后的QC样品的检测信号或比值(内标法) AS——未经萃取