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实验三酶促转氨反应一实验原理

氨基酸分子上的氨基转移到α-酮酸分子上的反应称转氨反应。由转氨酶催化的转氨反应是氨基酸代谢的重要反应之一。经转氨后，原来的氨基酸变成了酮酸，而原来的酮酸则变成新的氨基酸。

在动物机体中活力最强、分布最广的转氨酶有两种：一种为谷氨酸丙酮酸转氨酶（简称GPT），另一种为谷氨酸草酰乙酸转氨酶（简称GOT）。它们的催化反应如下：

GPT丙氨酸+α-酮戊二酸谷氨酸+丙酮酸此反应最终产物都是丙酮酸。测定单位时间内丙酮酸的产量即可得知转氨酶的活性。

丙酮酸可与2,4

–

二硝基苯肼反应，形成丙酮酸二硝基苯腙，在碱性溶液中显棕红色。再与同样处理的丙酮酸标准液进行比色，计算出其含量，以此测定转氨酶的活性。

丙酮酸

+

2,4

–

二硝基苯肼→丙酮酸二硝基苯腙（棕红色）

1.称取0.3g叶片——用剪刀将叶片剪碎——放于研钵中。2.量取4ml磷酸缓冲液，分三次加入研钵中（2，1，1），研磨成浆状，到入离心管中，5000rpm离心10min,

上清液即为酶粗提液。二实验步骤3.取4支试管——编号——按下表要求加样:试管号1(空白管)2(对照管)3(标准管)4(样品管)酶粗提液（ml）0.10.1Ala和α-酮戊二酸(ml)0.5标准丙酮酸液(ml)0.5磷酸缓冲液(ml)0.60.50.14.加样完毕摇匀用橡皮筋将4支试管扎牢置于40℃水浴中加热30min。5.取出冷却

每支试管各加0.5ml2，4-二硝基苯肼反应5min再每支试管各加5ml0.4N的NaOH溶液

摇匀

静止10min在λ=530nm下，测量吸光度OD值。三、计算：按下式计算丙酮酸生成量：Cx=样品中丙酮酸含量

Cs=标准丙酮酸溶液含量(0.002mM/ml)V=标准丙酮酸溶

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