《长三角地区水产养殖业中抗生素抗性菌株的产生及污染问题研究》7800字（论文）

第页共10页长三角地区水产养殖业中抗生素抗性菌株的产生及污染问题研究1引言 22水产养殖业中抗生素抗性菌株的产生及污染 22.1抗性菌株的产生 22.2抗性基因的污染来源 33水产养殖业中抗性基因的传播扩散及方法 43.1抗性基因的传播扩散 43.2抗性基因的检测方法 64开展此研究的必要性 7结论 8参考文献 9摘要：我国是世界第一水产养殖大国，约占世界养殖总产量的70%.但近年来由于水产养殖污染加剧，造成养殖环境质量不断恶化,导致病原生物种类增多和传播速度加快，养殖病害日趋严重，水产养殖中的病害问题特别是细菌性病害在密集型养殖系统中发生频繁且影响严重，这极大地限制了我国水产养殖业的发展，目前病害防治的主要方法是使用抗生素类药物。本文选取著名的水产养殖地——长三角作为研究对象，分析抗生素造成污染的原因。关键词：抗生素；抗性菌株；长三角地区1引言抗生素除了防治疾病之外，还有促进生长以及节约营养成分等方面的作用.目前抗生素作为饲料添加剂在动物养殖业中使用非常普遍.抗生素的长期滥用很可能会诱导动物体内产生抗生素抗性基因(Antibioticsresistancegenes,ARGs),ARGs经排泄后将对养殖区域及其周边环境造成潜在基因污染.目前在不同的环境介质如水体、沉积物、水生生物和细菌体内等均已检出ARGs的存在，并且有研究还发现ARGs能够通过可移动的遗传元件(Geneticmobileelements)在细菌之间传播，进而在环境中扩散，这将会对公共健康和食品安全构成严重的威胁.针对以上问题，本文对抗生素抗性基因在水产养殖业中的来源、污染现状、潜在的传播途径及其机制和相关的检测方法进行了系统综述，并指出了当前形势下我国开展水产养殖中抗生素抗性基因研究的必要性和重要性，建议政府和有关机构尽快开展水产养殖中抗生素抗性基因的污染机理与控制对策研究。2水产养殖业中抗生素抗性菌株的产生及污染2.1抗性菌株的产生目前，由于缺乏科学的管理和相应制度上的制约，一些养殖业主盲目追求产量，长期在饲料中添加抗生素以促进生长，因此近年来抗生素在水产养殖中的滥用现象越来越严重，直接后果是在水产环境和养殖动物体内诱导出抗性菌株.Kerry等(1996)从美国东南部的水产养殖池塘中.分离出了革兰氏阴性菌(主要是类志贺邻单胞菌和嗜水气单胞菌)，发现与未使用抗生素的河流相比，使用过抗生素的池塘中抗四环素、氯霉素、氨比西林和呋喃妥英的抗性细菌的数量明显增多.其他相关研究也证明在使用过抗生素后，抗性菌株普遍存在1990年前英国在渔业生产上从未使用过阿莫西林，因此在这以前从水产养殖地区分离的杀鲑气单胞菌均对阿莫西林敏感;几年之后阿莫西林开始用于水产养殖业，结果在一次疖病爆发中分离出了抗阿莫西林的菌株。随着各种抗生素的过度使用，细菌对抗生素的抗药性已由单一抗药逐渐发展为多重抗药，目前的研究也发现大多数抗性菌株的表现型为多重抗药性.多重抗药就是(MultipleDrugResistance,MDR)系指一种微生物同时对多种常用的抗生素类药物产生抗药性(张伟等，2008).细菌多重抗药性的产生与环境中的抗生素多重选择的压力密切相关.Novick(1981)指出在动物养殖业中使用亚治疗剂量的抗生素也会促进产生多重抗药性菌株.已有很多研究报道在水产养殖场的动物体内和环境中发现多重抗药菌株的存在.Tendencia和DeLaPena(2001)在菲律宾的一个养虾池塘中发现与未使用过抗生素的池塘比较，使用过恶喹酸的虾塘里抗多重药物(至少两种)的弧菌很常见.Schmidt等(2000)从虹鳟鱼养殖场分离出的气单胞菌株除了抗四环素外，大部分也抗磺胺嘧啶或甲氧苄氨嘧啶;Jun等(2004)从韩国患流行病的养殖鱼(包括比目鱼和鳗鱼)体内分离得到127个临床菌株，其中有20个抗四环素的爱德华迟钝菌株，经分析发现20个菌株都具有多重抗药性，除了抗四环素外，这些菌株对恶喹酸、萘啶酸、氯霉素、氨比西林、卡那霉素和链霉素等抗生素也有抗性;Penders和Stobberingh(2008)在荷兰南部的室内鲶鱼和鳗鱼饲养场利用能动气单胞菌作为指示细菌测定出氨比西林和土霉素的抗药率是100%，磺胺甲恶唑是24%，甲氧苄氨嘧啶是3%，环丙沙星和氯霉素分别是10%.由此可见在使用过抗生素的环境中普遍存在着多重抗药性菌株。细菌多重耐药性的产生除了与环境中多种抗生素同时存在产生的选择压力有关外，主要原因是多重抗药性基因可以在环境中微生物之间进行连锁传播，推测其机制与质粒(Plasmind)等可移动的遗传元件有关(Sunetal,2009).质粒大都携带某种抗性基因，并且不同大小的质粒含有的抗性基因不同.Udo和Grubb(1991)报道4.4kb质粒与链霉素耐药有关，23.8kb质粒可能携带多种抗菌药的抗性基因.Akinbowale等(2006)在86个至少对一种抗生素有抗性的菌株中发现74.4%的含有质粒，数量在1~10个之间，大小为2~51kbp.此外质粒还可以作为转座子(Transposon)及整合子(Integron)/基因盒(Genecassette)的载体，使得质粒DNA上的抗性基因通过转化、转导、结合等方式在同种属甚至不同种属细菌的质粒与质粒间、质粒与染色体间不断转移，并通过特异性的整合和重组使多种耐药基因聚集到细菌的耐药质粒上，致使细菌产生多重耐药性在抗生素选择压力下，质粒和与之相关的转座子使耐药性的转移和传播更加迅速，水平获得耐药基因的亚群可发展成优势菌群并将其垂直遗传给子代(李晓云等，2008).此外，整合子作为继质粒、转座子之后人类发现的又一重要的细菌多重耐药及水平传播机制，已经发现它的存在和多重抗性的表现型之间有较大的关联(Leverstein-vanHalletal.,2002)2.2抗性基因的污染来源抗生素在水产养殖业中的滥用不仅会引起水生动物体内的抗生素残留，而且在使用过程中未被水生生物吸收的抗生素、以及随水生生物粪便排泄的抗生素和穿过网箱未被生物食用的饲料中的抗生素最终溶入海水或随悬浮物沉降汇集于底部沉积物。残留在生物体内和进入环境中的抗生素会在养殖生物的肠道细菌内和环境细菌内诱导产生携带抗性基因的抗药菌株，经过质粒的水平转移等机制将ARGs传播给其它的细菌，造成抗性基因在水生环境中的扩散,这是抗性基因的一种污染来源。为了实现水产养殖业的可持续发展，更加合理地开发利用养殖资源，水产养殖业正在由传统的粗放型养殖场向集约式方向迈进，而集约式养殖场较传统养殖场更容易诱导产生抗性细菌.集约式养殖场通常使用的是食用过抗生素饲料的陆地动物的粪便，而粪便中可能含有残留的抗生素和抗性菌株，因此采自此类养殖场底泥中的细菌和鱼肠道内的细菌抗性水平可能会比传统养殖场的要高(Petersenetal,2002;PetersenandDalsgaard,2003a;2003b).这一方面由粪便中残留的抗生素所产生的选择压力所致，另一方面，可能是粪便中含有携带抗性基因的肠球菌将转座子(包括接合转座子)、抗性质粒转移到受体细菌所致.这些细菌进入鱼塘后，通过水平迁移等机制将抗性基因转移到水产环境和水产动物的肠道细菌体内而获得抗性.Petersen等人(2002)研究了集约式渔牧混养场对细菌抗药率的影响，发现从水底泥的混合样品中分离的指示菌不动细菌属对6种不同的抗生素的抗药率与实验之前相比有很大的提高，实验之前的抗药率是1~5%，两个月后对土霉素和磺胺甲恶唑的抗药率达到100%，对丙氟哌酸的抗药率大于80%。目前，除了水产养殖外，畜牧养殖业也广泛使用抗生素，禽畜动物肠道内被诱导出携带抗性基因的抗性菌株，这些抗性菌株最终通过地表径流和粪便的渗滤进入地下水、河流地表水和近岸海水中，由于水产养殖大多以河流地表水为供水水源，因此，河流中的抗性菌株进入水产环境内，通过细菌间的质粒交换，抗性基因进入水产动物的致病菌体内，造成潜在的抗性基因污染.图1ARGs种类3水产养殖业中抗性基因的传播扩散及方法3.1抗性基因的传播扩散目前所知的细菌抗药的基因机制有两个途径:1)自身基因突变.该类抗药性来源于细菌固有的(自然发生)特征，即本身就有抗药基因存在于其染色体上，也叫染色体介导的抗药性，在自然界的耐药菌中占次要地位;2)抗药基因的获得.细菌主要通过4种方式获得，即转化(Transformation)、转导(Transduction)、接合(Conjugation)和转座(Transposion).细菌的抗药性多为外在环境诱导下经可动遗传因子，如质粒(Plasmid)、转座子(Transposon)、噬菌体(Bacteriophage)、整合子(Integron)/基因盒(Genecassette)等的传递而获得.这种方式获得抗药性机率高，形成后较稳定，是引起抗药性散播的主要原因(曹文斌等，2005)Akinbowale等(2006)在澳大利亚的水产养殖区分离的86个抗性菌株中发现74.4%的菌株含有不同数量和大小的质粒.这表明细菌表现为抗药性很可能是因为有些细菌体内携带抗性基因，而这些抗性基因则位于质粒或转座子上，如sul2基因通常位于质粒上，并且具有广泛的宿主性(Scholzetal.1989;Smallaetal,2000);tet(M)通常和接合性转座子Tn1545-Tn916相结合，Tn1545-Tn916是一个广宿主的转座子，它可以在52个种24个属的细菌之间转移(ChopraandRoberts,2001;Clewelletal.,1995;Salyersetal.,1995)），这使得抗性基因可以通过染色体垂直传播或者质粒或转座子水平传播而在环境中广泛传播造成污染.由于抗生素在水产养殖业中长期的滥用,在养殖动物肠道内诱导出抗性菌株，这些编码抗生素抗性基因的菌株是水产环境中抗生素抗性基因最重要的来源.-旦微生物具有了这种抗性基因，它们能通过例如质粒交换来水平转移基因从而传播抗性基因.有些生物肠道菌中的抗性基因位于质粒、转座子等可动遗传因子(MobileGeneticElement).上，能够通过基因交换水平扩散到底泥和海水中的其它种的细菌中(罗义和周启星，2008).例如sul基因可以通过整合子和转座子或是利用噬菌体和移动质粒作为它们传播的工具(SmallaandSobecky,2002).许多研究表明某些tet基因也可以被接合性质粒或转座子携带而在环境中进行传播(Junetal.,2004;Agers覬etal.,2007;ChopraandRoberts,2001;Clewelletal.,1995;Salyersetal.,1995).不仅同菌属.间可以进行质粒的交换，研究还发现质粒的交换也可以发生在不同菌属.Rhodes等(2000)发现编码四环素抗性基因的相关质粒可以在不同的气单胞菌属和大肠埃希氏菌中传播.Twiddy和Reilly(1995)在东南亚的一个常使用抗生素的鱼塘中发现对抗生素产生抗性的沙门氏菌、嗜水气单胞菌和类志贺邻单胞菌，并发现编码抗性的质粒和转座子会从一种菌传播到另一种.菌，最终会将抗性质粒传播到在水产环境中不常见的致病菌体内.Akinbowale等(2006)从澳大利亚的水产地区分离的12个抗土霉素菌株中，有5个菌株可以将它们的R质粒转移到来自鸡、猪和人类的大肠杆菌受体中，而且tet(A)、tet(D)和tet(M)可以转移，tet(E)不可以，这可能是因为tet(E)基因通常是与非接合性质粒连接在一起的，此外在海洋水产养殖中，海水中的细菌也有可能将抗性基因转移到鱼肠道的细菌里(Nonakaetal.,2000)，也有报道当处于无抗性压力的条件下时，海洋细菌会在几代之后丢失质粒DNA(Chadnrasekaranetal.,1998).整合子是近年来在细菌中发现的天然克隆表达系统，它是一种基因片段，具有位点特异性重组功能，能识别、俘获及表达外来移动性基因盒，使得抗药基因在环境中发生扩散(刘婷婷和李凤云，2006).当整合子不能移动时，它便趋向于与转座子或是接合性质粒相连接，作为它们传播的工具(Ployetal,2000).已有研究表明气单胞菌属携带整合子，而整合子可以获得或丢失抗生素抗性基因(FluitandSchmitz,1999)有些地区的水产养殖区某种抗生素虽然已经被禁止使用很长时间，但仍可以在环境中追踪检测到此类抗生素的抗性细菌存在.Dang等(2006a)在中国北方的一个海参和海胆的养殖场内，从海参中分离的抗氯霉素菌株中，有65%的菌株含有catIV或catlI基因，而从海胆中分离的抗氯霉素菌株中，35%的含有catlI基因，而且所有对cat呈阳性的菌株还携带一个或两个tet(B)、tet(D)或tet(A).此外Dang等(2006b)在对中国一个海洋水产养殖场的研究中发现，分离出的多重抗药菌株中cat基因与tet(B)基因的出现有很好的相.关性.而早在1999年氯霉素在中国就已经被禁止用于海洋水产养殖，出现这种现象的原因有两个，一方面可能是因为氟苯尼考的使用，它是氯霉素的一种衍生物，另一方面可能是由于土霉素的交叉选择而导致产生交叉抗药性(CrossDrugResistance).交叉抗药性是指某种病原菌对一种药物产生耐药性后，往往对同一类的药物也具有耐药性的现象，产生这-现象的原因是因为同类的药物往往具有相同的作用靶位，而不同种类的药物结构不同，作用靶位也不同(CourvalinandTrieu-Cuot,2001).因此cat基因的出现极有可能是土霉素共同选择的结果，Courvalin和Trieu-Cuot(2001)推测其基因机制可能是tet基因与cat基因位于同一个可移动遗传因子，比如质粒、转.座子或整合子，这种推断尚需要进一步的研究证实.研究表明环境中携带抗性基因的细菌可以将抗性基因转移到人体致病菌中.例如肠球菌可以转移转座子(包括接合性转座子)、抗性质粒到很多受体菌体内(Morrisonetal.,1997)，所以它们可能会成为革兰氏阳性菌(包括人类致病菌)的抗性基因库.Furushita等(2003)在日本3个不同的渔场采集的鱼中检测出抗四环素菌株，结果显示鱼的菌株中携带的抗四环素基因的序列和从人类临床分离的菌株中存在的抗四环素基因的序列呈现出高度的相似性.Rhodes等(2000)研究发现土霉素抗性质粒在水产和医院分离的菌株之间发生了转移，这为抗性质粒在气单胞菌和大肠杆菌中转移提供了直接的证据.这些资料充分说明水产环境中的抗性菌可能会将抗性基因传播到人体内病原菌，使人致病菌携带抗性.另有研究表明，携带ARGs的微生物菌株死亡后，携带ARGs的DNA可释放到环境中并持久存在(Blumetal.,1997;HillandTop,1998;Crecchioetal.,2005)，原因是在脱氧核糖核酸酶(DNase)的保护下，防止其被降解.依此推断，水生环境中裸露的DNA分子最终可能会转入到其他生物体细胞内，造成抗性基因在水生环境中的传播和扩散，并可能通过直接接触或污染食物链等多种途径进入人体，增加人体的抗生素抗药性，使细菌感染性疾病的治疗更加棘手.抗生素在水产养殖业的大量使用,使水和土壤环境不仅成为抗性基因的储库，也成为抗性基因扩展和演化的媒介.图2抗生素抗生基因种类3.2抗性基因的检测方法抗性基因作为-种新型的污染物已经在不同的环境体系如河流底泥、海水、灌溉渠、污水处理场的出水、农场的泻湖等被检测出(Prudenetal.,2006;Aminovetal.,2001;2002;Smithetal,2004;Peietal.,2006;Kimetal.,2004;Henriquesetal.,2006)，最终可能会通过食物链进入人体内，对食品安全和人体健康构成严重的威胁，因此建立环境中抗性基因的检测方法就显得尤为重要.目前的抗性基因检测方法主要有两种，传统的方法是利用抗性平板法筛选出抗性细菌，对其进行总量的测定，并鉴定出抗性细菌的种属，然后从菌体中提取DNA,再用聚合酶链式反应(PCR)检测环境中的抗性基因.由于环境中许多微生物难以平板培养，主要是因为对其最适生长温度、pH、氧、营养成分等不十分清楚.因此，以传统微生物培养的方法评价抗性难免低估了微生物的种类.因此，发展了直接在环境样品中提取总DNA，再利用PCR方法分析环境中的抗性基因的方法.该方法与细胞抽提法相比较，优点是提取DNA率高，简便快捷(陈竹等，2007)，但从环境样品中直接提取的DNA样品难免会残存腐殖酸和一些酚类物质，对后续的实验如PCR、限制性内切酶等反应有一些影响，因此在提取的过程中需要对其进行纯化处理.细菌的总量测定一般采用最大可能数法(MPN)，这是一种应用概率理论来估算细菌浓度的方法.种属鉴定包括传统的生理生化鉴定和分子生物学鉴定方法.其中16SrDNA和BIOLOG就是较为常见的分子生物学鉴定技术.近年来，在传统PCR技术的基础上，发展了Realtime-PCR(RTQ-PCR)技术，实现了从定性到定量的飞跃.该技术的基本原理是在反应体系中加入荧光探针，运用Taq酶的5'-3'外切酶活性和荧光能量传递技术，巧妙地把核酸扩增、杂交、光谱分析和实时检测技术结合在一起，借助荧光信号的积累来实时监测整个进程，最后通过标准曲线对未知核酸模板进行定量分析的方法.Realtime-PCR技术的发展和完善，为环境中存在的抗生素抗性基因的研究提供了方法学.上极大的可能.除了上述常见的方法以外，有的研究(PhuongHoaetal.,2008;Mirandaetal,2003)也利用Southern印记杂交法龙ok(SouthernBlotting)和DNA-DNA杂交法(DNA-DNAHybridization)进行抗性基因的定性和定量.4开展此研究的必要性随着水产养殖业的迅速发展，抗生素在水产养殖中的应用越来越广泛，水产业的病害问题是制约其发展的一个重要因素，目前在世界范围内通用的防治措施是使用抗生素.目前欧美已经通过许可监督程序对水产品中的抗生素药残进行监测和控制，从而达到对抗生素使用的有效监管，我国作为水产业大国，水产养殖的年产出量不断增长决定了抗生素的使用不会迅速退出历史舞台，但我国尚未制订严格的监管措施，尽管有些药品(如氯霉素)属禁用药品，但在部分地区并未真正做到令行禁止，直接导致水产养殖业中抗生素使用管理混乱，因此在我国由抗生素诱导产生的抗性基因对环境造成的污染可能比世界其它各国更为严重，加之药品生产和使用监管力度不足，抗生素在养殖业中滥用的情况十分严重，直接后果即导致养殖动物体内抗性菌株的产生，并极有可能在环境中进行传播和扩散，对人体健康构成潜在威胁(Hunteretal.,1994;朱力军，2001).已有证据表明，畜牧活动能导致动物体内的抗性菌株扩散进入环境并将其携带的抗性基因传播给环境微生物(Chee-Sanford,2001;lsaacsonandTorrence,2002;Furushitaetal.,2003).一旦获得了抗药性，这些环境微生物可通过多种方式传播进入人体，对人类健康构成潜在的威胁，而且我国的水产养殖点多位于沿海滩涂，这使得抗性菌株和抗性基因更容易扩散进入公海水域，不但会对整个水生生态系统造成威胁，甚至对相邻国家的水域也会造成抗性基因的污染，这将直接有损我国在国际上进出口贸易的国际形象和经济收益(罗义和周启星，2008).抗生素作为水产养殖中重要的抗细菌性疾病药物，在现阶段仍具有不可替代的作用.因此，针对我国水产养殖业大量使用抗生素这一现状，开展渔业环境抗生素抗性基因污染的研究，揭示抗生素抗性基因在渔业环境中的扩散和传播规律，对于评价抗生素抗性基因的生态风险十分必要，不仅能确保我国水产养殖业的健康可持续发展，而且对于我国的生态安全和经济发展具有重要的现实意义目。结论目前，在我国对于抗生素抗性基因在环境中的来源、传播和扩散机制等研究数据还尚处于空白，水产养殖中抗性基因的污染尚未引起人们的足够重视，我国又是一个水产养殖大国，在抗生素的使用种类和数量方面还没有相应规章制度的约束，而且有些渔民缺乏这方面的知识，造成抗生素的滥用现象十分严重，直接导致环境中抗性基因的产生和传播扩散，所以呼吁政府和有关部门门]应加强对这一类新型环境污染物的重视，加强监管.相关研究应该集中在以下几个方面:1.养殖业中抗生素抗性基因的RTQ-PCR检测标准方法体系的构建;2.对国内重点水产养殖场进行针对性调查，确认我国水产养殖环境中抗生素抗性基因的种类和污染水平，分析ARGs与抗生素环境选择压力之间的关系;3.开展养殖环境抗生素抗性基因的来源、扩散和传播规律研究，分析环境因素的变化如光照、温度、pH以及氧对ARGs传播扩散的影响及机制;4.加强抗生素抗性基因对动物和人体的健康风险研究，研究抗生素抗性与养殖动物和人致病菌之间的关系，建立抗生素抗性基因生态环境安全评价和预警体系.参考文献[1]SapkotaA,SapkotaAR,KucharskiM,etal.Aquaculturepracticesandpotentialhumanhealthrisks:currentknowledgeandfuturepriorities[J].EnvironmentInternational,2008,34(8):1215-26.[2]VanBoeckelTP,BrowerC,GilbertM,etal.Globaltrendsinantimicrobialuseinfoodanimals[].ProceedingsoftheNationalAcademyofSciences,2015,112(18):.5649-5654.[3]ZhangQQ,YingGG,PanCG,etal.ComprehensiveevaluationofantibioticsemissionandfateintheriverbasinsofChina:sourceanalysis,multimediamodeling,andlinkagetobacterialresistance[J].Environmentalscience&technology,2018,49(11):6772-6782.[4]TatavarthyA.ComparisonofantibioticsusceptibilityprofilesandmoleculartypingpatternsofclinicalandenvironmentalSalmonellaentericaserotypeNewport[J].JournalofFoodProtection,2019,(4):74