扫描电子显微镜生物样品制备与观察-细胞生物学实验报告

细胞生物学实验报告扫描电子显微镜生物样品制备与观察姓名：学号：班级：专业：同组成员：【实验目的】了解扫描电镜的基本结构与工作原理了解扫描电镜的基本使用方法了解临界点干燥仪的工作原理了解扫描电镜生物样品制备的基本过程【实验原理】扫描电镜主要用于观察样品表面几何形貌。一般扫描电镜生物样品制备过程包括取材、固定、脱水、干燥以及导电处理等步骤。取材时应尽量保护待观察的样品表面（如细胞表面、组织或器官的上皮表面等），并且避免样品表面在清洗过程中的人为损伤。一般生物样品需经干燥后才能在扫描电镜下观察。由于表面张力的作用，含水量大的生物样品在自然干燥过程中，其表面形貌将发生严重变形。为了观察生物样品真实的表面形貌，通常采用临界点干燥法对样品进行干燥处理。当气液两相处于临界点时，气体、液体密度相等，表面张力为零。因此，对生物样品进行临界点干燥，可以较好地保护其表面形貌。水的临界温度和压力分别为374.1℃和218.3大气压，显然，此条件下生物样品将受到严重损坏。由于CO2的临界温度和压力较低，为31.4℃和72.9大气压，故通常选择CO2作为生物样品临界点干燥的工作介质。固定、脱水后的样品需经过乙酸异戊酯处理，然后利用临界点干燥仪对样品进行干燥。由于生物样品导电性低，未经过导电处理的样品在扫描电镜下观察时会产生荷电现象，从而影响观察和照相记录。为了减少荷电效应，对生物样品表面要进行导电处理，通常使用离子溅射仪在样品表面喷镀金属导电薄层。喷镀的金属包括：金（Au），铂（Pt）及其合金等，喷镀导电薄层厚度在10nm左右为宜。对于花粉粒等含水量较少的生物样品，可以经过自然干燥后在扫描电镜下观察。入射电子术与固体样品原子之间的相互作用1、入射电子术与固体样品原子之间的相互作用。具有一定的能量的电子入射固体厚样品后收到样品原子的散射，产生二次电子、背散射电子以及特征x射线等。二次电子是从样品表面约10nm深度范围内被入射电子激发的低能电子，其能量约为0~50eV。一部分入射电子在样品内部经多次散射后从样品表面射出，这些电子被称为背散射电子。样品中不同元素的原子在受到入射电子电离激发时可以发射特征X射线。扫描电镜主要是利用二次电子像观察厚样品表面形貌。在观察样品微区表面形貌的同时，利用X射线显微分析技术可以对样品中的元素进行定性和定量分析。图二百合花粉粒扫描电子显微镜像【讨论】思考题1、二次电子像的衬度与样品的何种特征有关？二次电子的产率η定义为二次电子数与入射电子数之间的比值，并且η∝1／cosθ，θ为入射电子束与样品表面法线之间的夹角。由于样品表面不是平整的，各点的θ值与η值不同，即样品表面各点的二次电子信号强度不同。因此二次电子像的衬度反应样品表面几何形貌。此外，由于入射电子束孔径角很小，二次电子像还具有景深大，立体感强的特点。2、为什么临界点干燥可以避免自然干燥对生物样品表面形貌的损伤？临界点干燥的原理是：在一定的温度和压力下，物质的液态和气态界面将会消失，液态瞬间转化为气态，形成非液非固的状态，即达到临界点（C.P）状态。在临界点时，表面张力消失，分子间的内聚力等于零，而在显微尺度上，表面张力对生物材料形态的影响十分强大。表面张力是存在于固-液、液-气界面上的主要物理力之一。液-气界面上表面张力的作用是造成生物样品收缩的主要原因。因此，利用临界点状态对材料进行干燥，材料理论上不会产生收缩和形变，对于质地较软的材料这种方法是最好的干燥方法。3、生物样品在扫描电镜观察前为什么要进行金属喷漆处理？由于生物样品导电性低，未经过导电处理的样品在扫描电镜下观察时会产生荷电现象，从而影响观察和照相记录。为了减少荷电效应，对生物样品表面要进行导电处理，通常使用离子溅射仪在样品表面喷镀金属导