液相色谱-质谱联用鉴定杂质

液质联用技术在杂质鉴定中的应用

目录第一章:

基本原理第二章：质谱在药品杂质鉴定中的应用2第三章：质谱在基因毒性杂质鉴定中的应用第一章:基本原理31.1

原子分子质量1.2

离子源1.3

质量分析器4JosephJohnThomson

1906NobelPrizeforPhysicsFrancisWilliamAston

1922NobelPrizeforChemistryWolfgangPaul

1989NobelPrizeforPhysicsJohnBennetFenn

2002NobelPrizeforChemistryKoichiTanaka

2002NobelPrizeforChemistry质谱特殊的天平：称量离子的质量。

原子分子质量MassSpectrometryisusedtodeterminethemassandstructureofmoleculesbasedonthemass-to-charge(m/z)ratioofthemolecularionanditsfragments.检测对象：荷电粒子m/z=mass-to-chargeratio（荷质比）=质谱非光谱Spectroscopyn.光谱学,波谱学,光谱仪Spectrometry:SpectrometerAbbreviatedto:Massspec.orMS没有光与波长的概念7原子质量原子构成：质子、中子和电子•中子=1.674928610-27kg•质子=1.672623110-27kg•电子=9.109389710-31kg•中子=1•质子=0.99862349•电子=0.00054386734•中子=939.56MeV•质子=938.27MeV•电子=0.511MeVE=mc28原子质量质量单位：碳12元素原子质量的1/12为一个原子质量单位•中子=939.56MeV•质子=938.27MeV•电子=0.511MeV9精确质量AtomMassofAtom#ofAtomsSumHydrogen1.007834040.31300Carbon12.0000033396.00000Nitrogen14.00307228.00615Oxygen15.994929143.95424Total608.27338PlusH1.0078311.00783Total609.28121Minuse-0.0005510.00055609.28066Reserpine(C33H40N2O9)10分辨率半峰宽m1分辨率=m1/(Dm/z)Dm/zatFWHM精确质量测定先决条件１）仪器具有足够的分辨率２）被测峰具有足够的峰强度11

四极杆离子阱TOF磁质谱四极杆飞行时间Accuracy100ppm100ppm10ppm<5ppm<1ppm-2ppmResolution<4000<400020,00060,00020,000-40,000m/zRange<4000<400020,00010,00020,000TandemMSMS2(triplequad)MSnMS2MS2MS2分辨率12同位素（isotope）定义：具有相同质子数，不同中子数的同一元素得不同核数自然界天然同位素准分子离子质子加和物：[M+H]+阳离子加和物：[M+Na]+、[M+NH4]+、[M+K]+二聚离子：[2M+H]+、[2M+Na]+准分子离子去氢离子：[M-H]-阴离子加和物：[M+Cl]-二聚离子：[2M-H]-15[M+H]+:373[M+Na]+:39516[M+H]+:822[M+NH4]+:839[M+H]+:844[M+H]+:86017第一章:基本原理181.2

离子源离子源（接口）进样系统离子源质量分析器检测器19离子源（接口）电子轰击EI

化学电离CI电喷雾电离ESI大气压化学电离APCI解吸附电喷雾DESI大气压分析探针ASAP20工作原理：

样品溶液从毛细管流出时，在电场与辅助气流的作用下喷成雾状的液滴，在加热气体的作用下，液滴中溶剂被蒸发，使液滴直径逐渐变小，因而表面的电荷密度增加，当达到雷利极限时，即表面电荷产生的库仑推斥力与液体表面张力相等时，则会发生“库仑爆炸”，把液滴炸碎，产生带电的更小液滴，此过程不断重复，直到液滴变得足够小，表面电荷形成的电场足够强，最终把样品离子从液滴中解吸出来，形成的样品离子通过锥孔，聚焦透镜等进入质谱分析系统。电喷雾离子源（ESI）22电喷雾离子源23大气压化学电离源(APCI)带电荷溶剂离子+++++++++++++++++++++++蒸汽加热+分析物离子电荷转移++++其他新型离子源24第一章:基本原理251.3

质量分析器质量分析器四极杆（Q）离子阱（IT）飞行时间（TOF）FTICROrbital-Trap空间串联时间串联IonPulserTurbo2Octopole1RoughPumpTurbo1Turbo1Turbo1QuadMassFilter(Q1)CollisionCellLens1and2HiSpeedDetectorAssemblyIonBeamCompressor*Hi-ResSlicerAssemblyTurbo2IonMirrorAssemblyFlightAssemblyCollisionCellTurbo2Turbo127空间串联时间串联28离子阱质谱全扫描图谱分析质量数选择碰撞诱导解离（CID）检测器检测IT-TOF

离子源离子传输部分质量分析器检测器3DIontrapTimeofFlight目录第二章：质谱在药品杂质鉴定中的应用3031杂质谱杂质：任何影响药品纯度的物质（中国药典）Impurity:anycomponentofasubstanceforpharmaceuticalusethatisnotthechemicalentitydefinedasthesubstance（EP）ICH相关限度32MaximumDailyDoseReportingThresholdIdentificationThresholdQualificationThreshold≤2g/day0.05%0.10%or1.0mgperdayintake(whicheverislower)0.15%or1.0mgperdayintake(whicheverislower)>2g/day0.03%0.05%0.05%液质联用鉴定杂质33应用液质联用:电喷雾质谱:与液相高流速兼容LC-UV:纯度测定MS:推测化学结构Templatestructureidentificationmethod:Template:maincomponentfragmentationfeaturesStudyfragmentationroutesofunknownpeaksProposethestructurebasedontemplate34HPLC方法质谱兼容HPLCESI-ITMSESI-QTOFMS碎片裂解途径解析元素组成制备液相色谱/合成1D,2DNMR目标化合物形成过程苄达赖氨酸苄达酸和赖氨酸复盐醛还原酶抑制剂预防、延缓白内障药物HPLC：ShimadzuLC-20AT型高效液相色谱仪色谱柱：Kromasil100-5C18柱（250mm×4.6mm，5μm）流动相：0.1%乙酸-乙腈（57：43）流速：1.0ml/min柱温：30℃波长：

227nm质谱仪：Agilent6538四极杆飞行时间质谱仪离子源：电喷雾离子源电压：4000V干燥气：11L/min雾化气：35psi毛细管温度：325℃扫描范围：50-1000苄达赖氨酸苄达赖氨酸227nm302nmImpurity1：0.19%Impurity2：0.29%Impurity3：0.10%123bendazac中国药典苄达赖氨酸苄达酸杂质1杂质2杂质3苄达酸杂质1杂质2杂质3负离子图谱苄达酸裂解机理杂质3表1负离子模式下二级质谱图中主要的碎片离子峰理论值与实验值的偏差计算Tab.1SummaryofMS2resultsforimpuritiesinnegativemode母离子子离子实验值计算值分子式偏差

(ppm)371(impurity3)－371.1408371.1401C23H19N2O3-1.9327327.1499327.1503C22H19N2O--1.2313313.1351313.1346C21H17N2O-1.6298298.1236298.1237C21H16NO--0.3249249.1032249.1033C16H13N2O--0.4235235.0876235.0877C15H11N2O--0.4192192.0826192.0819C14H10N-3.6杂质结构杂质3核磁共振（600MHz1HNMR，150MHz13CNMR）半制备液相（Shimadzusemi-preparativeHPLC）色谱柱：AgilentPrep-C18column(30mm×250mm,10um)流动相：0.1%乙酸-乙腈（57：43）流速：1.0ml/min柱温：30℃波长：227nm杂质3NMR1HNMR13CNMR杂质3HMBC苄达赖氨酸合成工艺杂质3形成过程色甘酸钠系列液相色谱条件开发：原料、滴眼液均适用强制降解实验：系统耐用性、强制降解路径鉴定9个杂质结构，其中有2个未知杂质，6个未知降解产物色甘酸钠抗过敏药，用于治疗过敏性哮喘，疗效较好欧洲药典方法:色谱柱:SymmetryshieldC184.6*150mm,3.5um流动相A:乙腈-10g/l四丁基硫酸氢铵(5:95)流动相B:乙腈-10g/l四丁基硫酸氢铵(50:50)检测波长:330nm梯度洗脱方法:0-15min:0%-100%15-20min:100%新开发方法:色谱柱:SunfireC184.6*150mm,3.5um流动相A:10mM甲酸铵流动相B:乙腈检测波长:254nm梯度洗脱方法:0-30min:3%-50%35min:50%四丁基硫酸氢铵：离子对试剂色甘酸钠欧洲药典对照品原料药滴眼液防腐剂色甘酸钠热破坏碱破坏氧化破坏色甘酸钠EP对照品原料药滴眼液Impurity1Impurity2Impurity3防腐剂Cromoglycate:469Impurity1:469Impurity2:731(468+263)Impurity3:415杂质2元素组成:C36H27O16杂质2杂质361DegradationProducts光破坏碱破坏氧化破坏62降解产物63降解产物64PrecursorionsProductionsMeasuredmassCalculatedmassFormulaError(ppm)469(cromoglycate)－469.0757469.0765C23H17O11+-1.7451451.0654451.0660C23H15O10+-1.3263263.0549263.0550C13H11O6+-0.4245245.0443245.0444C13H9O5+-0.4207207.0286207.0288C10H7O5+-1.0469(impurity1)－469.0774469.0765C23H17O11+1.9451451.0677451.0660C23H15O10+3.8423423.0736423.0711C22H15O9+5.9263263.0565263.0550C13H11O6+5.7245245.0461245.0444C13H9O5+6.9207207.0284207.0288C10H7O5+-1.9高分辨质谱数据65降解路径杂质来源目录67第三章：质谱在基因毒性杂质鉴定中的应用GenotoxicimpurityRegulatoryToxicologyandPharmacology44(2006)198–211GenotoxicimpurityRegulatoryToxicologyandPharmacology44(2006)198–211达比加群酯DB-10ATTCvalue:1.5μg/dayintakeMaximum：300mg/day5.0μg/gGenotoxicimpurity岛津LC-30AD超高效液相色谱仪；岛津LCMS-8050三重四级杆质谱仪岛津液质联用仪控制软件为LabSolutions5.72色谱柱：岛津Shim-PackGISC18（2.1x50mm，2μm）流速：0.4ml/min，柱温：40℃PDA检测波长：254nm时间（min）流动相A（%）流动相B（%）070301.570302.010907.010907.1703010.07030UPLC梯度洗脱表接口HV：4.0kV（正离子模式），-3.0kV（负离子模式）InterfaceTemperature：350℃DLTemperature：250℃HeatingBlockTemperature：350℃NebulizingGasFlow：2.5L/minHeatingGasFlow：12L/minDryingGasFlow：8L/minDwellTime：60msGenotoxicimpurityGenotoxicimpurity图8.溴乙酸、对氨基苯腈、DB-10混合对照色谱图Genotoxicimpurity对氨基苯腈Y=1499.93X+491.612（r2=0.9999）线性范围为0.4-40ng/ml溴乙酸Y=476.807X+1051.52（r