白骨壤盐胁迫响应基因AmSK32的克隆及异源转化拟南芥

前言1.1研究背景土壤盐渍化问题确实是一个全球性的挑战，特别是在中国，它给农业生产以及生态环境带来了深远的冲击。由于人类行为的增多，盐渍化的土地范围正在逐渐增长，这已经给我们的粮食供应以及生态系统带来了极其严峻的考验REF_Ref14545\r\h[1]。传统育种方法虽然在一定程度上能够解决一些问题，但存在耗时、成本高等缺点。相比之下，分子育种方法具有针对性强、耗时短、操作简便等优势，因此备受研究者青睐REF_Ref15865\r\h[2]。红树林这一森林生态系统主要分布在热带与亚热带的滨海湿地区域，由生长在高潮线附近的木本植被构成，这些植物大多是四季常青的乔灌木类REF_Ref15940\r\h[3]。这些植物群落在净化海洋生态、抵御风浪侵蚀、吸收并固定大气中的二氧化碳、保护生物多样性等环境层面具有极其重要的功能，因此被誉为“滨海生态屏障”与“蓝色地球之肺”。除此之外，红树林亦是多种稀有且濒临灭绝水生鸟类的重要栖息之所，并为各类鱼类和甲壳类海洋生物提供了繁衍与发展的适合环境REF_Ref16041\r\h[4]。白骨壤（Avicenniamarina），学名海榄雌，白骨壤的特点就是它的根系特别发达，浅层的根系宽度比树冠还要宽，最长的地方甚至能长到8米以上。这样的根系结构让白骨壤能够吸收到更多的土壤养分。而且，它还有像手指一样的气生根，在贫瘠的沙滩环境中具有显著的适应性。因此，白骨壤被大家称为红树林里的先锋树种REF_Ref16080\r\h[5]。白骨壤亦属于具备排盐能力的红树植物，堪称对盐分的耐受度最高之物种。其通过叶及茎部表层细胞形成的盐腺结构排出体内过量盐分，确保体内盐浓度保持在较低水平，以此方式减少盐分对其生长的不良影响REF_Ref16126\r\h[6]。植物对盐分的适应性由多种因素构成，这些因素包括生物形态、电解质均衡、渗透压调控以及抗氧化机能等。生物体的形态结构与功能是相适应的。以红树植物为例，在长期进化过程中，红树植物的根、茎、叶等器官的进化越来越适应高盐度的环境。叶片肉质化可以储存更多的水分从而稀释盐分保护植物REF_Ref16175\r\h[7]；叶片的表皮毛可以减少蒸腾，泌盐性植物具有盐腺可以将多余的盐分转移到盐腺的收集细胞，通过分泌细胞排出体外，使体内盐度达到平衡范围REF_Ref16224\r\h[8]。根部能为植物充分吸收土壤里的水分，其根部细胞富含三萜醇，具有拒盐作用，可以减少木质部盐分含量REF_Ref16266\r\h[9]。此外，根系内皮层的凯氏带也助于减少盐分吸收和运输，共同保护红树植物免受盐分伤害REF_Ref16315\r\h[10]。植物对盐分的抵抗能力取决于其离子稳态的精细调控，尤其是通过精确管理细胞内部的Na+、K+、H+等离子浓度REF_Ref16364\r\h[11]。例如，白骨壤和梧桐树等植物通过高效的机制维持这种微妙的平衡。值得注意的是，盐腺细胞的排盐过程是一个能量密集型活动，它依赖于ATP的生成，而这个过程主要由H+质子泵驱动，它不仅有助于排出过量的Na+REF_Ref16407\r\h[12]，还防止了细胞质中Na+浓度过高引发的代谢混乱REF_Ref16456\r\h[13]。同样，钾离子在维持细胞内的离子平衡中扮演着核心角色。在面临NaCl压力时，细胞内的钠离子水平显著上升，与此同时钾离子含量也随之显著增加，这种策略有效地防止了离子失衡引发的潜在损害。因此，钾离子的动态调节在抵御盐害中发挥着至关重要的作用REF_Ref16505\r\h[14]。渗透调节是植物适应高盐环境的重要手段，植物通过合成和积累一些渗透调节物质，如脯氨酸、甜菜碱等，以维持细胞的渗透压平衡REF_Ref16554\r\h[15]。此外，抗氧化系统也在植物耐盐过程中发挥着重要作用，植物还可以通过增强抗氧化酶的活性，清除活性氧自由基，减轻盐胁迫对细胞的损伤REF_Ref16593\r\h[16]。先前的探索揭示了植物GSK3蛋白激酶可能在处理非生物压力方面扮演重要角色。经RT-qPCR检测，在盐胁迫条件下，AtSK家族的三个成员（AtSK13、AtSK31和AtSK42）的基因表达量有所增强。多数拟南芥GSK3基因在转录水平上响应，诸如NaCl、PEG之类的逆境刺激REF_Ref16645\r\h[17]，而BIL2不仅在转录层面上受到NaCl的影响，还受到与逆境紧密相关的植物激素脱落酸的诱导REF_Ref16701\r\h[18]。有趣的是，过表达BIL2的转基因植物相对于对照组显示出更高的盐胁迫耐受性REF_Ref16737\r\h[19]。而AtSK22/BIL2的异源表达挽救了盐胁迫敏感酵母突变体REF_Ref16779\r\h[20]。过表达AtSK22/BIL2的转基因拟南芥中盐胁迫应答基因的表达增加，从而增强其对盐胁迫的抗性REF_Ref16821\r\h[21]。AtSK11在非生物胁迫反应中的功能正逐渐被阐明。研究表明，AtSK11通过调节细胞氧化还原状态的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（G6PD）的磷酸化来增强拟南芥对盐胁迫的耐受能力。在高盐胁迫条件下，AtSK11的激酶活性增加，而AtSK11基因的敲除则导致植物对盐胁迫的敏感性增加REF_Ref16883\r\h[22]。进一步的研究表明，高盐诱导了G6PD的活性，并且在AtSK11敲除突变体中，这种活性增加更为显著，而在过表达AtSK11的突变体中则呈现下降趋势。通过质谱分析和突变体研究的组合分析，确定了G6PD6的Thr467残基是AtSK11介导的磷酸化位点，进一步的研究发现，将G6PD6的Thr467残基突变为T467A会降低AtSK11介导的活性，而模拟磷酸化的T467E突变则会增强G6PD6的催化活性，这表明AtSK11通过磷酸化G6PD6的Thr467残基来激活G6PD6，从而增强拟南芥对盐胁迫的耐受能力REF_Ref16883\r\h[22]。图1-1白骨壤叶片和根中AmSKs基因在不同盐处理时间点的表达情况GSK3广泛参与调控植物的生长发育以及逆境胁迫等过程，但其在白骨壤中的研究很大程度上仍然是未知的。我们前期研究发现（图1-1），在盐胁迫处理条件下，AmSK32在白骨壤的叶片和根组织中均被诱导表达，暗示该基因可能在白骨壤盐胁迫响应调控中发挥功能。为了深入了解其功能，本研究通过对AmSK32基因进行克隆并遗传转化拟南芥，通过筛选获得阳性过表达拟南芥转基因株系（AmSK32-OE），为深入探究AmSK32基因的盐胁迫响应功能和调控机制奠定前期基础，为我国抗逆育种工程提供基因资源。1.2技术路线2材料和方法2.1实验材料白骨壤幼苗购自于海南东寨港，种植于富含营养的土壤中，该土壤由营养土：蛭石3：1的比例混合而成。在室内的培养环境中，设置温度为22℃，并进行每日16小时的光照与8小时的黑暗循环，经过一个月的适应性培养后，进一步对植株进行了盐分胁迫的实验研究。2.2实验仪器设备表2-1实验器材及厂商名称来源恒温摇床高压灭菌锅数显恒温水浴锅高速冷冻离心机电热鼓风干燥箱超净工作台上海知楚仪器有限公司ZEALWAY上海博讯实业有限公司医疗设备厂海南光威科技有限公司上海一恒科学仪器有限公司苏洁净化2.3培养基的配置表2-2LB固体培养基的配制配方用量/L胰蛋白胨酵母浸粉氯化钠琼脂蒸馏水10.0g5.0g5.0g10.0g补足至1000mL注：配制LB液体培养基时不加入琼脂表2-3MS培养基的配制配方用量/L蔗糖琼脂粉MS蒸馏水30.0g8.0g47.0g补足至1000mL表2-4蔗糖悬浮液配制配方用量/L蔗糖Silwetl-77AS蒸馏水50.0g0.5mL1.0mL补足至1000mL2.4实验方法2.4.1白骨壤总RNA的提取使用RNAprepPure多糖多酚植物总RNA提取试剂盒（天根，中国）在冰上对白骨壤提RNA。1.在液氮冷冻条件下，选取50-100mg的植物组织器官（叶片、果实果肉、根部、花），迅速研磨成粉。2.将粉末与500μL裂解液SL（475μL裂解液，25μLβ-硫基乙醇）混合，12000rpm，2min。3.上清液转移至CS过滤柱，12000rpm，2min，吸取上清液。4.在吸附柱CR3中加入0.4倍上清液体积的无水乙醇。12000rpm，15s，弃废液。5.将350μL去蛋白液RW1加入CR3中，12000rpm，15s，弃废液。6.DNaseⅠ工作液制备比例为，DNaseⅠ储存液：RDD缓冲液为1：7。7.向CR3中加入80μLDNaseⅠ静置15min。再加入350μLRW1，12000rpm，15s，弃废液后放回收集管。8.加入500μL漂洗液RW至CR3，12000rpm，15s，弃废液再放回收集管。9.重复步骤810.12000rpm，2min。将CR3放入新的RNase-Free离心管中，滴加30-50μLRNase-FreeddH2O至吸附膜，静置2min。12000rpm，1min，得到RNA溶液。2.4.2cDNA的获取以RNA为模板用TransScriptOne-StepgDNARemovalandcDNASynthesisSuperMix试剂盒（全式金，北京）进行反转录。遵循操作手册的具体步骤，所有步骤均在冰上进行，操作步骤如表2-5。1.加入表2-5cDNA反应体系组分用量TotalRNA/mRNAAnchoredOligo(dT)18primer(0.5μg/μL)2×TSReactionMixTransScriptRT/RIEnzymeMixgDNARemoverRNase-freeWater5μL1μL10μL1μL1μL补足至20μL2.轻轻混匀，42℃孵育30分钟。3.85℃加热5秒钟失活TransScriptRT/RI与gDNARemover。2.4.3琼脂糖凝胶电泳1.依据所需要的琼脂糖浓度以及溶液的总量，准确秤出所需量的琼脂糖并加入到锥形瓶里。2.取适量的TAE缓冲溶液倒入之前放有琼脂糖的锥形瓶里，注意动作要轻柔以防琼脂糖形成颗粒。3.把装有混合物的锥形瓶放进微波炉，加热至琼脂糖完全融解，溶液变得清亮没有粘稠感。4.冷水冲洗降温至不烫手即可。5.使用移液枪加入溴化乙锭（核酸染料）并迅速摇晃使其充分混匀。6.将胶倒入已插好齿梳的制胶模具中，（从一个角匀速倒入，且倒胶时温度不可太低，否则凝胶不均匀）7.静置15min，等待胶完全凝固，垂直拔出齿梳。8.取出琼脂糖凝胶刮去底部边缘多余的胶后放入电泳槽中，放稳后使TAE注满样品槽。9.在电泳槽中加入TAE至液面恰好没过胶面上表面。2.4.4大肠杆菌扩大培养1.接菌划线法：将接种环蘸取菌液后，在培养皿中划线，线要首尾相连，注意接种环不能频入培养基内获得单菌落。2.挑菌（1）每个LB固体培养基用枪头挑5个大的单菌落进已装有10μL无菌水的200μL离心管中，作标记。（2）挑完菌后在离心管中用移液枪吹打混匀，进行培养。2.4.5大肠杆菌的转化大肠杆菌转化操作步骤如下。（大肠杆菌感受态细胞购自普因特生物工程有限公司）1.将感受态细胞在-80℃环境中取出，并迅速将其置于碎冰上，经5min左右待细菌逐渐解冻之际，加入目的DNA，手动摇晃EP管底部来轻和混合，静置30min于冰上。2.将EP管浸入42℃水浴锅中进行热击1min，期间不得摇晃EP管。3.热击完成后，立刻将EP管转移到冰上冷却，静置约5min，期间不得晃动。4.事先准备无菌的LB液体培养基，然后利用移液枪把800μL的LB培养基注入管中，接着放入设定为37℃、200rpm的恒温摇床中培养1h。5.在常温下以每分钟6000rpm离心5min以沉降微生物，随后保留大约150μL的上清液。利用移液器轻柔地吸吹打重悬菌体，并吸取出一定量的细菌溶液施加于已准备好含有抗性Kana的LB平板上。用无菌的涂布棒匀布细菌，再将培养皿用封口膜封好，放置在37℃的恒温箱中倒置培养12至16小时。2.4.6大肠杆菌质粒提取实验使用试剂盒为TIANprepMiniPlasnidKit（天根，中国），使用前将无水乙醇加入漂洗液PW中。1.向吸附柱CP3加入500μL平衡缓冲液BL，12000rpm离心1min，弃废液，放回收集管。2.取3mL待提取质粒菌液放入离心管，12000rpm离心1min，弃上清液后加入250μLP1溶液，进行吹打混匀。加入250μLP2溶液，上下翻转几次。再加入350μLP3溶液，上下翻转几次，2000rpm离心10min。3.将上清液转移至CP3，12000rpm离心1min，弃废液，放回收集管。4.向CP3注入500μL去蛋白液PD，12000rpm离心1min，弃废液，放回收集管。5.加600μLPW至CP3，12000rpm离心1min，弃废液，放回收集管。6.重复操作步骤57.12000rpm离心2min，彻底去除CP3中PW。8.将CP3放入新的离心管中，滴加60μLEB洗脱缓冲液至吸附膜核心区域，静置2min，12000rpm离心2min，获得含有质粒溶液的离心管。2.4.7农杆菌的转化农杆菌感受态细胞购自庄盟生物，转化操作步骤如下。1.将农杆菌感受态细胞从-80℃冰箱中取出，置于冰上待其融化。2.将1µg质粒缓慢加入感受态细胞中，轻柔混匀。3.将混合物置于冰上，静置5min，让细胞充分吸收质粒。4.准备好液态氮，将装有混合物的离心管迅速浸入液态氮中，让混合物在液态氮中进行5min的冷冻。5.37℃水浴5min。6.将500μL的无抗性液态LB培养基加入进离心管中，放入28℃、200rpm的摇床中培养，培养时间控制在3至6小时，使菌体得到恢复。7.在常温条件下以8000rpm速度进行离心操作3min，分离细菌，并保留大约150μL的上清液部分。之后使用移液器轻轻吹洗以重新悬浮细菌，利用无菌的涂布棒在已准备好含有Kana和Rif抗生素的LB平板上均匀涂布。随后以封口膜密封平板，在无光线的条件下，将平板倒置并放置在28℃的环境中培养2至3天。2.4.8拟南芥的种植1.培育拟南芥的培养土采用的是营养土：蛭石依照3：1的体积比混合而成。当拟南芥幼苗在培养皿里萌发并长出2至4片真叶，便可将其转植入泥土。转移幼苗之后，需用一层透明塑胶薄膜覆盖以维持潮湿度。待24小时后去除塑胶膜。2.温室环境为22℃，并进行每日16小时光照/8小时黑暗。定期浇水培养2-3个月。2.4.9拟南芥的花序浸染1.在对拟南芥进行花序浸染处理之前，先将其豆荚和展开的花朵剪除；2.挑取农杆菌培养皿中单一菌落加入5mL含kana和Rif的LB培养基中。28℃，180rpm，18h，4℃保存。3.将100μL的Kana和200μL的Rif溶入含200mLLB液体培养基的溶液中，充分振荡使之混合均匀。再将此溶液分装至150mL的锥形瓶中，确保两种抗生素在锥形瓶中的工作浓度稳定在50μg/mL。接着每瓶加入9μL的菌液，置于28℃下，以200rpm的速度小幅摇动过夜培养。4.将已充分震荡的菌株溶液添入含有抗生素Kan和Rif的100毫升LB培养基中，之后于摇床中以28℃、150rpm的条件下培养9至10小时，直至其OD600值达0.8至1.2；5.4℃，8000rpm,10min，去上清液，并使用事先准备好的悬浮液重新吹打细菌，调整至OD600值为0.4至0.6；6.然后将栽培的拟南芥花序沉浸于含菌液的蔗糖悬浮液中，每棵植株处理时间为1min。随后，对处理过的拟南芥进行标记，暗处培养12小时，之后将其移至光照培养条件下生长。间隔三日再次进行同样的浸染处理，总计进行三轮，完成后等待拟南芥达到成熟阶段并收集种子。3结果与分析3.1白骨壤不同组织器官RNA的提取本实验对白骨壤不同组织器官进行RNA的提取如图3-1所示，提取的RNA中，28SrRNA条带的亮度均超过18SrRNA条带的两倍，并且在电泳带中未观察到5SrRNA条带，表明抽取的总RNA质量很高，没有降解现象发生。提取的总RNA中反转录得到cDNA，随后将其作为PCR的模板，用于扩增目的片段。图3-1白骨壤AmSK32基因不同组织器官提总RNA注：1：花2：成熟果3：幼果4：幼叶5：成熟叶6：老叶7：幼根8：地下呼吸根9：地上呼吸根3.2白骨壤不同组织器官cDNA的验证表3-1cDNA验证反应体系组分用量TemplatecDNAPrimerF(10μM)PrimerR(10μM)2×MagicGreenTaqSuperMixddH2O1μL0.5μL0.5μL5μL补足至10μL表3-2cDNA验证反应程序程序名称温度时间Stage1预变性95℃3minStage2循环反应95℃58℃72℃10sec10sec20secStage3彻底延伸72℃5min注：程序Stage2为30-35cycles将提取得到的RNA为模板，通过反转录获得cDNA，将cDNA进行PCR琼脂糖凝胶电泳鉴定如图3-2所示，获得了大小约为100bp左右的条带，符合预期可作为模板后续对AmSK32基因进行全长克隆。图3-2白骨壤AmSK32基因不同组织器官cDNA验证注：1：花2：成熟果3：幼果4：幼叶5：成熟叶6：老叶7：幼根8：地下呼吸根9：地上呼吸根3.3AmSK32在白骨壤组织中的表达分析利用RT-qPCR对AmSK32基因在白骨壤不同组织中的表达情况进行检测，结果显示如图3-3所示，在正常生长条件下，AmSK32在花器官中的表达量较高；随着叶片的生长发育，该基因的幼叶、成熟叶和老叶中的表达呈现递增的趋势；表明AmSK32基因在白骨壤不同组织中及同一组织不同生长发育阶段可能发挥不同的调控作用。图3-3白骨壤AmSK32基因组织表达模式图3.4AmSK32目的基因全长的克隆以白骨壤根部cDNA为模板对AmSK32基因进行全长克隆，全长克隆引物序列为：F：5′ATGAATATGATGCGTCGGGT3′，R：5′TCACTTCTTGGCATGCTCTG3′；反应体系及反应程序如下所示。表3-3AmSK32目的基因全长克隆PCR反应体系组分用量2×PhantaMaxMasterMix上游引物（10μM）下游引物（10μM）cDNAddH2O5μL0.5μL0.5μL1μL补足至10μL表3-4AmSK32目的基因全长克隆PCR反应程序程序名称温度时间Stage1预变性95℃3minStage2循环反应95℃60.5℃72℃15sec15sec1min30secStage3彻底延伸72℃5min注：程序Stage2为32cycles用2×MagicGreenTaqSuperMix试剂盒（吐露港，中国）验证AmSK32全长基因克隆引物，设置55.3℃、56.7℃、58.3℃、60.5℃4个梯度退火温度，进行PCR扩增。，从图3-4可知AmSK32基因的引物条带在60.5℃退火温度较明亮,可继续用高保真酶进行AmSK32全长基因的克隆。通过图3-5可知获得大小约1400bp的片段,条带大小符合预期表明已获得目的基因可进行后续实验。图3-4白骨壤AmSK32基因克隆引物验证图3-5AmSK32全长基因的琼脂糖凝胶电泳3.5质粒线性化我们选用pBinGlyRed3-35S质粒作为载体，pBinGlyRed载体上含有编码红色荧光蛋白的基因，如图3-6所示。图3-6pBinGlyRed质粒图限制性内切酶选用XmaⅠ和EcoRⅠ，对pBInGlyRED载体质粒进行双酶切，制备线性化载体，双酶切体系如表3-5所示。表3-5双酶切质粒反应体系组分用量质粒Red10×NEBufferEcoRⅠXmaⅠddH2O10μL5μL1μL1μL补足至50μL上述反应体系于PCR仪中37℃孵育30min。将酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳后，进行胶回收。3.6重组载体构建表3-6重组载体反应体系组分用量5×CEIIBufferExnaseII插入片段线性化载体ddH2O1μL0.5μL2μL1.5μL补足至5μL将上述体系放在PCR仪中进行反应，温度设为37℃，时长设为30min，结束后将反应液－20℃保存或用于后续实验。3.7大肠杆菌阳性转化子筛选将上述连接产物转化大肠杆菌，涂布于培养皿中，在恒温培养箱中进行过夜培养，获取单克隆如图3-7所示。对培养皿中单菌落挑取进行菌液PCR验证，产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，如图3-8所示，获得了约为1500bp大小的条带，符合预期，可用于后续实验。图3-7大肠杆菌培养在含kana的LB平板上表3-7大肠杆菌菌液PCR反应体系组分用量大肠杆菌菌液PrimerFPrimerR2×MagicGreenTaqSuperMixddH2O1μL0.5μL0.5μL5μL3μL表3-8大肠杆菌菌液PCR反应程序程序名称温度时间Stage1预变性95℃3minStage2循环反应95℃56℃72℃10sec10sec1min50secStage3彻底延伸72℃5min注：程序Stage2为30-35cycles图3-8AmSK32基因大肠杆菌菌液PCR鉴定注：1-16为AmSK32大肠杆菌菌液3.8重组质粒的提取及验证在大肠杆菌菌液PCR后，根据结果挑选3个PCR条带明亮且单一的菌液进行质粒的提取，将提取出来的质粒进行琼脂糖凝胶电泳如图3-9所示，条带大小符合预期，表明质粒质量和完整性符合要求，可送出测序，通过图3-10可以确认质粒载体上的其他重要序列完整，插入的目的基因序列正确。表明重组质粒构建成功，可用于后续转化农杆菌。图3-9质粒AmSK32电泳图注;1为AmSK32-9-1、2为AmSK32-9-2图3-10测序结果与AmSK32CDS比较3.9农杆菌阳性转化子筛选挑取单菌落摇菌进行菌液PCR。PCR产物通过琼脂糖凝胶电泳检测，如图3-11所示，图中可知，通过PCR产物琼脂糖凝胶电泳获得了大小约1400bp的条带，符合预期，可用于后续实验。表3-9农杆菌菌液PCR反应体系组分用量农杆菌菌液PrimerFPrimerR2×MagicGreenTaqSuperMixddH2O1μL0.5μL0.5μL5μL3μL表3-10农杆菌菌液PCR反应程序程序名称温度时间Stage1预变性95℃3minStage2循环反应95℃56℃72℃10sec10sec1min50secStage3彻底延伸72℃5min注：程序Stage2为35cycles图3-11AmSK32基因农杆菌菌液PCR鉴定注：1-8为AmSK32农杆菌菌液3.10拟南芥浸染目前用于研究拟南芥遗传转化的方法采用农杆菌介导的花序浸染法如图3-12所示。花序浸染法的优点在于其简便性、高效性以及稳定性。通过这种方法，研究人员可以直接获得转基因种子，从而进行后续的实验和分析。图3-12花序浸染法注：a图为拟南芥苗、b图为将拟南芥倒置在含有AmSK32基因菌液的悬浮液中3.11阳性苗筛选将转基因拟南芥收种后用卤素灯照射，选择被激发后呈现红色的种子，从而得到转基因种子，发现拟南芥T0代种子在卤素灯下种子呈现红色。表明AmSK32-OE载体已成功转入拟南芥。拟南芥T1代转基因幼苗长至2-4片真叶时，对20株拟南芥提取DNA，进行阳性鉴定。图3-13可知，除1、13两株系拟南芥外，其余植株条带大小符合预期目的基因片段大小。可说明这18株拟南芥为阳性苗。图3-13转基因拟南芥PCR阳性鉴定注：1-20为AmSK32T1拟南芥株系、WT为野生型拟南芥3.12结论我们研究了AmSK32基因在应对盐胁迫过程中的功能，分析了其表达模式和对盐胁迫的响应。结果表明，AmSK32基因在不同组织中的表达水平存在显著差异，提示了其在白骨壤中具有一定的组织特异性。通过分析转录组数据，我们发现在盐胁迫下，AmSK32基因在叶片和根部的表达量存在差异，可能参与了抗盐胁迫的过程。RT-qPCR验证结果证实了AmSK32基因对盐胁迫的表达量高。AmSK32基因表达模式分析：AmSK32在花器官中的表达量较高；随着叶片的生长发育，该基因的幼叶、成熟叶和老叶中的表达呈现递增的趋势；表明AmSK32基因在白骨壤不同组织中及同一组织不同生长发育阶段可能发挥不同的调控作用。本实验通过提取白骨壤中的AmSK32基因并进行盐实验，有望进一步明确该基因在调控白骨壤盐胁迫响应方面的功能。这不仅有助于深入了解白骨壤的耐盐机制，还可能为其他林木抗逆品种的培育提供新的候选基因和理论依据。有望为解决土壤盐渍化问题提供新的思路和方法。同时，这也将有助于推动分子育种技术的发展和应用，为现代农业的可持续发展做出贡献。3.13后续实验安排1.阳性转基因拟南芥AmSK32表达量检测。2.继续种植T2代观察表型。3.获取T3代转基因株系。开展盐实验检测拟南芥生化指标及盐markergene表达量进一步明确AmSK调控白骨壤盐胁迫响应功能。参考文献张志强,徐中民,程国栋,等.黑河流域张掖地区生态系统服务恢复的条件价值评估[J].生态学报,2002,(06):885-893.张丽,陈丰酆,王红霞,等.甘薯类胡萝卜素的代谢调控研究进展[J].农业生物技术学报,2023,31(08):1719-1729.杜照奎,陈河&

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