第十七章 医药基因工程课件

18医药基因工程第十七章医药基因工程18医药基因工程自１９７２年ＤＮＡ重组技术诞生以来，基因工程技术得到飞速发展，并在医疗领域中展露出独特的优越性。基因工程药物就是利用基因工程技术生产的药物。基因工程药物是将药物蛋白或多肽的编码基因通过特定的受体细胞中，通过受体生物或者细胞表达出药物蛋白或多肽，最后将其纯化并制成药剂的过程。基因工程药物生产的过程与其他基因工程产品的基本原理是相通的，基本过程都包括了载体构建，工程菌或细胞培养，目的产物的分离纯化与鉴定等。18医药基因工程从１９８２年最早的基因工程药物－－胰岛素上市到２００４年底，已经有１００多种基因工程药物通过审查并上市，另外还有３００多种基因工程药物进入二期及三期临床实验，涉及治疗１５０多种疾病。我国于１９９３年批准了第一个基因工程药物重组人干扰素a－１b的生产，标志着我国基因工程药物生产实现了零的突破。我国药品市场上基因工程药品主要有基因工程乙肝疫苗，重组干扰素，重组人红细胞生成素等２２种自主开发的基因工程药物。18医药基因工程第一节基因工程药物的开发状况18医药基因工程一.基因工程药物的分类１.按照结构组成不同分类：蛋白多肽类药物，基因工程疫苗和核酸类药物三类。２.按照作用方式分类：基因水平作用药物，转录水平作用药物和蛋白质水平作用药物。18医药基因工程３.按照药物作用机理分类：其一：蛋白或多肽药物，通过蛋白自身的生理生化特性而抵抗疾病其二：基因工程疫苗，基因工程抗体和ＤＮＡ疫苗，基于抗原抗体反应的原理而抵抗疾病其三：反义核酸，核酶和ＲＮＡi，基于中断基因表达而抵抗疾病。18医药基因工程二.基因工程药物的发展１.反应器的变迁根据反应器的不同可将蛋白多肽类基因工程药物的发展分为三个阶段：

a.早期大多数蛋白多肽类基因工程药物通过细菌和酵母等微生物来表达。

b.后来发展了真核生物细胞表达系统，利用离体培养的昆虫细胞和脊椎动物（如哺乳动物和鸟类）细胞表达蛋白多肽类药物。

c.近年来发展的动植物生物反应器为基因工程药物的开发带来美好的前途。18医药基因工程２.从基因工程到蛋白质工程随着技术的进步，人们通过蛋白质工程可获得修改了氨基酸序列的蛋白质或多肽。通过定点突变、功能域的交换、分子进化等手段，已经开发了一些活性提高、适应性改善和专一性增强的蛋白药物。３.从蛋白药物到核酸药物

传统药物是通过增加某些人体内源性的有益蛋白多肽或者破坏致病蛋白本身来治疗疾病；而核酸类基因工程药物则是提供产生蛋白的基因，通过破坏或者扩大基因的功能来克服疾病。基因工程药物的开发关键在于探知什么蛋白或多肽、或核酸可以成为药物，已经通过什么样的方式制备药物或通过什么样的方式使用药物。18医药基因工程三.基因工程药物的产业化状况第一个基因工程药物－－基因工程人胰岛素的问世期间经历了不到十年。至１９７６年第一个以基因工程制药为对象的美国Ｇenentech公司成立以来，有药物进入临床实验的生物技术公司已有约５００个。在２００２年，超过８０种基因工程药物获准在美国和欧盟使用，７５０中正在进行临床实验，市场份额超过１５０亿美元。我国共有２２种基因工程药物和疫苗，其中４种为具有自主知识产权的”一类“新药，进入临床研究的大约有１５０种，销售收入超过３亿人民币。18医药基因工程表18医药基因工程第二节基因工程蛋白和多肽药物18医药基因工程一.基因工程胰岛素１.胰岛素与糖尿病

胰岛素（insulin）是一种激素，能够调节糖代谢，促进葡萄糖转变为糖原并储存于肌肉和肝内。当人体胰腺的Ｂ－细胞不能产生足量的胰岛素时，就会导致人体内的葡萄糖浓度增高，并伴随因胰岛素分泌或作用缺陷引起的糖、脂肪和蛋白质代谢紊乱，即糖尿病。而对于胰岛功能完全消失的Ⅰ型糖尿病患者，不注射胰岛素就无法维持生命。18医药基因工程２.胰岛素的结构胰岛素是一种由两条多肽链（Ａ链和Ｂ链）组成的蛋白质。Ａ链含有２１个氨基酸，Ｂ链含有３０个氨基酸，链间通过二硫键结合。胰岛素在人体内合成的过程中首先合成前胰岛素原（preproinsulin），包括信号肽序列、Ａ链、Ｂ链和连接序列４个部分。胰岛素是经过去掉信号肽序列后形成胰岛素原，去掉连接序列后剩下的Ａ链和Ｂ链通过二硫键结合，形成了胰岛素。（图１８—１）18医药基因工程18医药基因工程３.基因工程胰岛素的生产方式主要有两种生产方式：

a.利用大肠杆菌为受体，分别表达胰岛素Ａ链和Ｂ链，再分别提取和纯化产生的Ａ链和Ｂ链，最后利用化学方法使两条链之间形成二硫键，从而得到胰岛素。

b.以酵母为受体分泌表达人胰岛素。在胰岛素编码基因前段增加一个信号肽编码序列，这个信号肽引导合成的胰岛素从细胞内分泌到周围的培养基中，从而简化了胰岛素的纯化过程，最后通过酶学反应使之变成人胰岛素。18医药基因工程二.基因工程人红细胞生成素１.人红细胞生成素的组成和生物活性

成熟的人红细胞生成素（ＥＰＯ）是一种由１６５个氨基酸组成的糖蛋白，多肽结构中由４个半胱氨酸形成２条二硫键，相对分子质量为３４×１０３

ＥＰＯ又称促红细胞生成素或红细胞生产刺激因子，是一类造血生长因子，刺激和调节哺乳动物红细胞的生成，维持外周血红细胞处于正常水平。

肾是产生ＥＰＯ的主要器官，目前只有应用基因工程技术生产ＥＰＯ才能满足患者的需求。18医药基因工程２.重组红细胞生成素的生产人类ＥＰＯ位于第７号染色体长２２区，１９８５年克隆到其cＤＮＡ。由于糖基化的问题，目前只利用脊椎动物表达系统来生产人红细胞生成素，其糖基化特性与人体中自然产生的糖基化特性最相近。方法：通过将编码人红细胞生成素的基因装入哺乳动物细胞表达载体，转染二氢叶酸还原酶缺陷的ＣＨＯ细胞（ＣＨＯ－dhfrˉ）株，并进一步筛选获得高产人红细胞生成素的ＣＨＯ。经过一系列细胞培养和蛋白质纯化等工艺制备过程，产生有生物学活性的重组人ＥＰＯ。现在上市的红细胞生成素主流产品都是通过基因重组技术，利用中国仓鼠卵巢细胞（Ｃhinese

hamster

ovary，ＣＨＯ）生产的。18医药基因工程三.基因工程干扰素１.干扰素的结构组成、生物活性和临床应用

干扰素（interferon，ＩＦＮ）是一种具有广谱抗病毒、抗肿瘤和免疫调节作用的可溶性糖蛋白细胞因子，最早于１９５７年发现。干扰素是一类多功能细胞因子，按其结构和功能的差异可以分为三类，即干扰素α

、干扰素β和干扰素γ。干扰素α含有２３种不同的亚型，干扰素β和干扰素γ都只有１种亚型。干扰素α的成熟产物由１６５～１６６个氨基酸组成，其中含４个半胱氨酸，形成对生物活性至关重要的２个二硫键。干扰素α主要由白细胞、Ｂ淋巴细胞、成纤维细胞和一些肿瘤细胞分泌；临床上主要用来治疗白血病，以及一些慢性病毒，如乙型肝炎、丙型肝炎和疱疹病毒感染。

18医药基因工程2.基因工程干扰素的生产早期制备是通过诱导或重组诱导天然或人工培养的人体细胞或血细胞产生天然干扰素。利用基因工程生产干扰素：

a.先要获得干扰素的编码基因；

b.利用诱生剂诱导细胞表达干扰素；

c.然后提取干扰素的mＲＮＡ，反转录成cＤＮＡ；

d.将干扰素编码基因通过合适的表达载体，导入大肠杆菌进行表达可产生大量干扰素；

e.经过分离纯化便可制成药物制剂。18医药基因工程四、基因工程疫苗疫苗的定义：由灭活或减毒的病原体做成的可预防相应病原物引起疾病的药物，通过接种人或动物在其体内建立抗感染免疫反应而产生保护作用。１.基因工程疫苗的分类：

a.亚单位疫苗。指用病原体的组分制成的疫苗，包括病毒的结构蛋白和细菌的脱毒毒素蛋白，其中病毒的结构蛋白是指病毒组成成分中能引起人体对病毒颗粒产生免疫反应且不致病的蛋白组分；细菌脱毒毒素蛋白是利用ＤＮＡ重组技术在基因水平上对细菌的毒素蛋白进行脱毒所获得的基因工程疫苗。

b.无毒疫苗或减毒活疫苗。利用ＤＮＡ重组技术去掉致病菌的毒素基因后得到的即保留了其侵入细胞和刺激免疫系统的能力，却又不能引起疾病的减毒病原菌。

c.疫苗载体。把目的基因转到已经在临床上使用的安全的活疫苗中，利用该活疫苗作为载体表达目的抗原基因，从而达到针对某种传染病的免疫保护作用。

18医药基因工程２.重组乙型肝炎疫苗乙型肝炎的定义：由乙型肝炎病毒（ＨＢＶ）引起的、以肝为主要病变并可累及多器官损害的一种传染病。乙型肝炎病毒颗粒由囊膜和含有ＤＮＡ分子的核衣壳组成，又称Ｄane颗粒。最初的乙型肝炎疫苗都是血液乙型肝炎疫苗，是从乙型肝炎患者血液中分离提取乙型肝炎表面抗原（ＨＢsＡg）。疫苗的制备一般选定具有免疫原性的乙型肝炎表面抗原基因片段，将起插入表达载体，并引入到与表达载体相对应的宿主细胞，构成重组体。重组体像一个加工厂，可以表达、加工、生产出乙型肝炎表面抗原，即得到基因工程疫苗。18医药基因工程（１）.重组酵母乙型肝炎疫苗用来表达抗原的酵母主要是酿酒酵母、汉逊酵母和毕赤酵母。表达质粒上用来在酵母中表达ＨＢsＡg的主要部件有３个：⑴在酵母中表达ＨＢsＡg的启动子。⑵不含有内含子的乙型肝炎病毒ＨＢsＡg的基因。⑶在酵母细胞中终止ＨＢsＡg转录的ＤＮＡ序列。利用酵母细胞表达ＨＢsＡg存在缺点：⑴酵母细胞不能分泌ＨＢsＡg颗粒；⑵酵母细胞对ＨＢsＡg蛋白的糖激化与哺乳动物的不同，使得获得的酵母ＨＢsＡg可能具有与血液ＨＢsＡg不同的免疫原性；⑶在酵母中装配２２nmＨＢsＡg

颗粒不稳定；⑷酵母细胞产生的ＨＢsＡg需要化学方法处理才能与血液的ＨＢsＡg相同，在这过程中可能改变ＨＢsＡg分子的结构，从而减小ＨＢsＡg抗原性。18医药基因工程（２）.重组中国仓鼠卵巢细胞（ＣＨＯ）乙型肝炎疫苗将乙型肝炎表面抗原基因片段重组到中国仓鼠卵巢细胞（ＣＨＯ）内，通过对细胞的培养增殖，分泌乙型表面抗原（ＨＢsＡg）于培养液中，经纯化，加佐剂氢氧化铝后制成疫苗。优点：⑴ＣＨＯ乙型肝炎疫苗产生的ＨＢsＡg的糖基化与血液ＨＢＶ颗粒的糖基化一样；⑵产生的ＨＢsＡg颗粒是以自然方式装配的，而不需要其他的化学处理；⑶装配的２２nmＨＢsＡg颗粒最后会被分泌到培养基中，不需要裂解细胞，简化了纯化步骤；⑷成本不高，有利于那些负担不起现有的高价疫苗的患者。18医药基因工程五.基因工程抗体抗体的定义：是机体受抗原刺激后由Ｂ淋巴细胞产生，并且能与该抗原发生特异性结合的具有免疫功能的球蛋白，是体液免疫应答中发挥免疫功能的最主要的免疫分子，主要分布与血清中，在组织液和外分泌液中也存在。常规抗体是针对多种不同抗原决定蔟产生的抗体，又称多克隆抗体；而针对某种抗原决定蔟的抗体称单克隆抗体，一般由杂交瘤细胞分泌。在临床上，抗体可用于抗肿瘤、抗感染、抗器官移植排斥反应、抗血栓形成和解毒，以及构建独特型疫苗、治疗自身免疫性疾病和变态反应疾病，此外还可用于体外诊断和发挥体内药物导向作用。基因工程抗体在临床上可发挥更多更重要的作用。18医药基因工程第三节基因工程抗体18医药基因工程一.抗体的结构抗体分子是由４条多肽链组成的四聚体，即由２条相同的轻链（Ｌ）和２条相同的重链（Ｈ）组成，重链之间以及轻链之间通过二硫键连接，呈Ｙ字型结构（图１８－２）。重链由４５０个氨基酸组成（如抗体ＩgＧ），轻链由２１４个氨基酸组成，完整抗体的相对分子质量约为１５０×１０３。抗原的识别位点位于轻链和重链的Ｎ端区域，该区称称作抗体的可变区（Ｖ区），识别位点就在Ｖ区内的３个互补决定区（ＣＤＲ），也称超变区，每个ＣＤＲ长约５～１６个氨基酸。Ｖ区以外的部分称为框架区（ＦＲ），其氨基酸序列相对保守，不与抗原分子直接结合，可维持抗体的空间构型。抗体分子含有多个功能区，除Ｖ区外，每一条轻链含有１个保守区（Ｃ区）ＣＬ，每一个重链含有３个保守区（ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３）。18医药基因工程18医药基因工程二.天然抗体的局限性抗原有多种不同抗原决定蔟，可刺激产生多克隆抗体。这种抗原是不均一的，会影响检测抗原的特异性及敏感性，在临床上应用受到很大限制。单克隆抗体的定义：是由识别一种抗原决定蔟的细胞克隆所产生的均一抗体，可视为第二代抗体，具高度特异性、均一性，且亲和力强、效价高，在临床上发挥了重要作用。单克隆抗体在临床中的问题：⑴单克隆抗体具有免疫原性；⑵杂交瘤制备的单克隆抗体在人体内的半衰期只有５～６h，不利于药效发挥作用；⑶吸收差，抗体相对分子质量大，很难通过血管进入细胞间隙，大大降低治疗效果；⑷生产复杂，价格较高。18医药基因工程三.基因工程抗体的种类１.单克隆抗体的人源化为了解决鼠源抗体的免疫原性问题，应改造抗体，构建人－鼠嵌合抗体和人源化抗体。

a.人－鼠嵌合抗体通过基因重组，将鼠源单克隆抗体的Ｆv片段替换人源抗体的相应片段，制成人－鼠嵌合抗体（图１８－３）。７０％序列来自人源抗体，３０％序列来自鼠源抗体；可保留抗体的特异性结合位点，也可减弱其免疫原性。

b.人源化抗体是对嵌合抗体进一步改进的结果，即用鼠源单克隆抗体的ＣＤＲ所获得的杂合抗体，９５％序列来自人源抗体，５％的序列来自鼠源抗体，最大限度地使鼠源抗体人源化（图１８－４）。抗体的抗原结合特性保留，在人体内产生免役原性的程度降到最低。18医药基因工程

18医药基因工程２.小分子抗体为了解决穿透性问题，对抗体改造，保留抗原结合位点，成为小分子抗体，分为下面５种：

a.Ｆab抗体抗体的Ｆab片段由重链的Ｖ区和Ｃm区与轻链以二硫键相连，能发挥抗体的抗原结合功能，大小为完整抗体的１／３。

b.单链抗体将抗体的ＶＨ和ＶＬ用连接肽连接，形成具有抗原结合能力的单链抗体多肽，即所谓的单链抗体（ＳcＦv）。其大小仅为完整抗体的１／６，免疫原性弱，药物动力学优于Ｆab片段和完整抗体，能有效到达完整抗体无法达到的靶部位。18医药基因工程

c.单域抗体抗体结合抗原的部位主要在Ｖ区，只含有Ｖ区的小分子抗体，如ＶＨ或ＶＬ，也能保持原单克隆抗体的特异性，这种小分子抗体称为单域抗体，其大小为完整抗体的１／１２，其只有一个功能区，制备简单，更容易穿过靶细胞。

d.超变区多肽由单个ＣＤＲ多肽构成的小分子抗体称为超变区多肽，其只有１６～３０个氨基酸，具有与抗原结合的能力，穿透力极强。但亲和力低，稳定性不高，实际应用有很大局限性。

e.双体抗体将两种不同抗体的ＶＨ区和ＶＬ区通过连接肽（５～１０个氨基酸）连接，形成“杂交”的单链抗体称作双体抗体（diabody），也称双特异性抗体。在宿主细胞中表达后，２条链自动折叠，形成双特异性的抗体片段，其大小为ＩgＧ的１／３或Ｆab的１／２，是相对分子质量最小的双功能抗体，在免疫诊断和治疗方面有广阔的应用前景。18医药基因工程３.双功能抗体双功能抗体的定义：天然的抗体分子是双价单特异性的，将小分子抗体（如Ｆab或Ｆv）与其他蛋白如毒素、酶、细胞因子及受体分子连接在一起，可形成一种新型分子，这样的杂和分子称双功能抗体。双功能抗体即可以与靶位点结合，又可将特定的活性分子导向特定部位，发挥其生物学功能，如杀死肿瘤细胞、发挥催化功能等。将人细胞受体或黏附分子与抗体的恒定区（主要是Ｆc片段）的Ｎ段连接，形成免疫黏连素，既可发挥抗体的效应功能，又能发挥细胞黏附功能。对于杀伤缺少相应表面抗原的肿瘤细胞有一定意义，可减少肿瘤的免疫逃逸。18医药基因工程４.人源性抗体制备人源单克隆抗体的２种方法：

a.噬菌体抗体库噬菌体抗体库技术是噬菌体表面展示技术在基因工程抗体应用上的一个成功范例；通过噬菌体表面展示技术，可将目的蛋白或多肽的编码基因与编码Ｍ１３噬菌体颗粒末端蛋白的基因Ⅲ构建成融合基因，将含有融合基因的重组Ｍ１３噬菌体转染大肠杆菌，可以在噬菌体颗粒表面展示目的蛋白。（图１８－５）18医药基因工程18医药基因工程b.人源性抗体转基因小鼠通过构建转基因小鼠，可使小鼠产生人源性单克隆抗体。用人的抗体基因转入小鼠并替代小鼠的相应基因，产生能分泌人抗体的转基因小鼠，第一个获得的人源性抗体是抗破伤风类毒素的单克隆抗体。在转基因小鼠基础上，建立了一种产生人抗体的小鼠模型ＸenoＭouse。将小鼠的全套抗体基因敲除掉，同时将人的大部分轻链和重链基因插入到小鼠的染色体中，当用抗原刺激小鼠时就可产生人源性抗体。利用该模型已制备了多种类型的人单克隆抗体，如抗人表皮生长因子受体的人源性抗体。18医药基因工程５.基因工程抗体的产生⑴大肠杆菌表达系统⑵酵母表达系统⑶哺乳动物表达系统⑷植物表达系统⑸昆虫表达系统18医药基因工程第四节核酸类药物18医药基因工程一.反义核酸药物反义核酸是一些人工合成的单链反义分子，可以通过碱基互补原则与被感染细胞内的某个靶标mＲＮＡ或ＤＮＡ结合，抑制或封闭该基因的转录和表达，或切割mＲＮＡ使其丧失功能。反义核酸作为药物可以治疗正常蛋白超量表达的疾病，如癌症，炎症，病毒或寄生虫感染。根据组成的特点可将其分为反义ＲＮＡ，反义ＤＮＡ，肽核酸和核酶。18医药基因工程１.反义ＲＮＡ机理：利用反义ＲＮＡ可以与mＲＮＡ结合形成互补双链，阻断核酸蛋白体同mＲＮＡ的结合，从而抑制了mＲＮＡ翻译成蛋白质的过程。反义ＲＮＡ在细胞核中与mＲＮＡ结合后会干扰其加工和剪切，如加帽和加poly（Ａ）尾，还会干扰mＲＮＡ转运至细胞质。反义核酸和mＲＮＡ结合后还使得mＲＮＡ更加易被核酸识别而降解，从而大大缩短mＲＮＡ的半衰期。反义ＲＮＡ除了可以影响基因的表达外，还可与引物ＲＮＡ前体互补结合，从而抑制ＤＮＡ复制。反义ＲＮＡ可以人工合成，更多的是将目的ＤＮＡ以反方向插入载体通过反义表达载体产生。通过这些载体可用于研发新型，高特异性和高效的反义治疗药物，在治疗艾滋病和麻疹以及恶性肿瘤方面起到了一定作用。18医药基因工程２.反义ＤＮＡ反义ＤＮＡ的定义：也称反义寡核苷酸或反义脱氧核苷酸，是一种人工合成的，能与mＲＮＡ互补的，用于抑制翻译的短小反义核酸分子。反义ＤＮＡ与mＲＮＡ结合后还可以诱导ＲＮaseＨ的产生，降解ＤＮＡ－ＲＮＡ复合物中的ＲＮＡ，从而大大缩短了mＲＮＡ的半衰期。反义ＲＮＡ可以通过自动合成仪，但其很易被降解，为提高其稳定性，亲和力，降解靶核酸的能力以及其他性能，由此催生了第一代反义核酸药物硫代磷酸脱氧寡核苷酸（ＰＳ－ＯＤＮ）。第一个反义核酸药物福米韦生就是ＰＳ－ＯＤＮ药物，由２１个硫代磷酸脱氧核苷酸组成，核苷酸序列为５‘－ＧＣＧＴＴＴＧＣＴＣＴＴＣＴＴＣＴＴＧＣＧ－３’，具有强大的抗病毒作用。18医药基因工程３.肽核酸肽核酸是以肽链骨架代替核糖－磷酸骨架的ＤＮＡ类似物，是通过计算机模拟设计出来的新核酸类似物。以２－氨基乙基甘氨酸为骨架，４种碱基为侧链，碱基通过亚甲碳基与骨架相连，保持与天然核酸中相邻碱基以及碱基与骨架间相近的键数目，相邻碱基间间隔６个键，碱基与骨架间为２～３个键。肽核酸保留了与互补ＤＮＡ或ＲＮＡ杂交的性能，亲和力得到进一步提高，同时，其化学和生物学稳定性更强，不易被核酸酶和蛋白酶降解；从化学角度看，更易进行大规模生产。18医药基因工程４.核酶核酶是一类具有催化活性的ＲＮＡ分子，具有核苷酸水解活性,可特异性剪切ＲＮＡ分子，相当于ＲＮＡ酶。核酶可以调节基因的表达，在ＲＮＡ的自我裂解，自我剪切，tＲＮＡ的转录后加工等过程中起重要作用。可用于药物的开发，抑制特定基因的表达。核酶具有特定的催化域和底物结合域。底物结合域可通过碱基互补与靶序列结合，相当于反义ＲＮＡ；而催化域可在特定位点剪切目的ＲＮＡ。通过改变结合域的序列，核酶可切割特定序列的mＲＮＡ。核酶用作药物的一个优点是不易引起动物或人的免疫反应。具有催化活性的脱氧核酶（ＤＮＡzyme），是通过合成随机寡核苷酸库，从中筛选到一个具有核酶活性的寡核苷酸。该寡核苷酸含一个由１５个核苷酸组成的催化域，两侧是７～８个核苷酸的臂，与目标ＲＮＡ互补配对。针对不同目的基因的脱氧核酶已经在体外和体内发生了酶学反应。18医药基因工程二.核酸疫苗１.核酸疫苗的工作方式核酸疫苗又称基因疫苗或ＤＮＡ疫苗，是利用基因重组技术将编码抗原的基因装入载体，然后直接导入动物体内，通过机体细胞的转录系统合成蛋白，产生的蛋白作为抗原诱导免疫系统产生免疫应答，即通过细胞和体液免疫反应产生抗体，从而达到预防和治疗疾病的目的。２.疫苗载体核酸疫苗是通过疫苗载体将抗原编码基因导入机体而激发免疫的。导入方式有⑴裸ＤＮＡ直接注射到肌肉内；⑵用脂质体包裹ＤＮＡ后在注射；⑶将ＤＮＡ用基因枪注入体内；⑷通过去毒的内生细菌引导ＤＮＡ进入体内。疫苗载体是一种穿梭质粒载体，含有真核表达系统的启动子，以及用于真核细胞的选择标记；用于动物实验的载体还含有在哺乳动物细胞中复制的病毒复制区；为提高疫苗的免疫原性，载体中还加入具有强烈佐剂作用的ＣＧ序列。典型的核酸疫苗载体有pcＤＮＡ３.１，以及在此基础上去掉病毒复制单位并用于双宿主可用的卡那霉素抗性基因替换氨苄青霉素抗性基因和新霉素抗体基因的改建载体pＶＡＸ１。（图１８－６）

18医药基因工程３.核酸疫苗的特点优点：⑴安全性好，没有感染的危险；⑵免疫效果好，核酸疫苗能在自身细胞中产生于自然抗原接近的外源性蛋白，能诱导产生类似自然抗原的免疫应答；⑶制备简单，只需对编码抗原的基因进行克隆；⑷核酸疫苗的本质是核酸分子，因而不同于蛋白质和活疫苗，可以在室温条件下保存，不存在疫苗的冷藏和低温运输问题，从而保证ＤＮＡ疫苗的高效接种率；⑸免疫应答持久，外源基因的不断表达可持续提供抗原。18医药基因工程三.ＲＮＡ干扰１.ＲＮＡ干扰现象

ＲＡＮ干扰（ＲＮＡi）是指对应于某种mＲＮＡ的正义ＲＮＡ和反义ＲＮＡ组成的双链ＲＮＡ（dsＲＮＡ）分子使mＲＮＡ发生特异性降解，导致其不能表达的转录后基因沉默（ＰＴＧＳ）现象。

ＲＮＡi发挥作用包括两个阶段：

⑴起始阶段：双链ＲＮＡ分子进入细胞后被称为Ｄicer的核酸酶切割为２１～２３个核苷酸长的小分子干扰ＲＮＡ片段（siＲＮＡ）。Ｄicer核酸酶属于ＲＮaseⅢ家族，能够特异识别双链ＲＮＡ，产生的小片段ＲＮＡ的３‘端都有２个突出碱基。然后双链siＲＡＮ与核酸酶结合形成ＲＮＡ诱导沉默复合体（ＲＩＳＣ）。⑵效应阶段：siＲＡＮ打开双链从而激活ＲＩＳＣ，激活的ＲＩＳＣ通过碱基配对与对应的mＲＮＡ结合，并在距离siＲＡＮ３’端１２个碱基的位置切割mＲＮＡ。同时，siＲＡＮ可作为引物并以mＲＡＮ为摸板合成新的dsＲＮＡ；这样又进入上述循环，继续对