高效液相色谱法课件

08-高效液相色谱法1第八章高效液相色谱法08-高效液相色谱法28.1概述

第八章高效液相色谱法8.2高效液相色谱仪8.3主要分离类型和原理8.4高效液相色谱固定相8.5高效液相色谱流动相

8.6影响分离的因素8.7分离类型的选择

08-高效液相色谱法38.1概述1.高效液相色谱法

在经典液相色谱基础上，引入气相色谱的理论而发展起来的，以液体为流动相的现代柱色谱分离分析方法。HPLC:采用高压输液泵，高效微粒固定相和高灵敏度检测器。08-高效液相色谱法4

经典LCHPLC柱之内径1~5cm~0.4cm长度50~100cm15~50cm填充材料粒度150µm~200µm4µm~10µm使用压力1~10atm50~200atm分离时间0.5h~天0.05~1h2.高效液相色谱和经典液相色谱的比较8.1概述08-高效液相色谱法58.1概述3.高效液相色谱和气相色谱的比较分析对象及范围：GC——气体和低沸点的稳定化合物——只占有机物总数的20%；HPLC——高沸点、高分子量的稳定或不稳定化合物——占有机物总数的80%。08-高效液相色谱法68.1概述流动相的选择：GC——有限的几种“惰性”气体，只起运载作用，对组分作用小；HPLC——液体或各种液体的混合——除了起运载作用外，还可与组分作用，并与固定相对组分的作用产生竞争，即流动相对分离的贡献很大，可通过溶剂来控制和改进分离。操作温度：GC需高温；HPLC通常在室温下进行。08-高效液相色谱法78.1概述4.高效液相色谱法的特点

高柱效优点：“三高”“一快”“一广”

高灵敏度

高选择性

分析速度快

应用范围广泛（可分析80%有机化合物）缺点：仪器设备费用昂贵，操作严格08-高效液相色谱法88.1概述5.高效液相色谱法的适用对象

高效液相色谱适用于分析高沸点不易挥发的、受热不稳定易分解的、分子量大、不同极性的有机化合物；

生物活性物质和天然产物；

合成和高分子化合物，以及无机和有机离子型化合物。08-高效液相色谱法98.1概述6.高效液相色谱法的应用

生命科学：氨基酸、多肽、蛋白质，核碱、核苷、核苷酸、核酸（RNA、DNA）等生命物质的纯化和分析；

药物分析：合成药物的纯化及质量控制，中草药有效成分的分离、制备及纯度测定以及临床医学的药代动力学研究中的分离分析。08-高效液相色谱法108.1概述食品分析：

①食品本身组成,特别是营养成分，如糖、有机酸、维生素、蛋白质、氨基酸、脂肪的分析；②食品添加剂，如防腐剂、抗氧化剂、合成色素、甜味剂和保鲜化学物质的分析；③食品污染物，如农药残余和黄曲霉素等的分析。08-高效液相色谱法118.1概述环境监测：

用于分子量大,挥发性低、热稳定性差的有机污染物的分离和分析。

如多环芳烃、酚类、多氯联苯、邻苯二甲酸酯类、联苯胺类、阴离子和非离子表面活性剂、有机农药等。08-高效液相色谱法128.1概述

精细化工：具有较高分子量和较高沸点的有机化合物，如高碳数脂肪族或芳香族的醇、醛和酮、醚、酸、酯等化工原料，以及各种表面活性剂、药物、农药、染料、炸药等化工产品的分析。

制备分离:

在许多科学研究和生产领域，往往需要制备或提取一些高纯化合物。08-高效液相色谱法138.2.1示例8.2.2结构8.2.3主要部件8.2高效液相色谱仪08-高效液相色谱法148.2.1示例08-高效液相色谱法158.2.1示例08-高效液相色谱法168.2.1示例08-高效液相色谱法178.2.2结构08-高效液相色谱法18色谱柱进样器泵及控制器数据处理及控制在线脱气机检测器8.2.3主要部件08-高效液相色谱法198.2.3主要部件1.高压输液系统

由于高效液相色谱所用固定相颗粒极细，因此对流动相阻力很大，为使流动相较快流动，必须配备有高压输液系统。它是高效液相色谱仪最重要的部件，一般由储液罐、高压输液泵、过滤器、压力脉动阻力器等组成，其中高压输液泵是核心部件。

08-高效液相色谱法20机械注射泵机械往复泵多用于流量要求在1-50

L/min范围的微型HPLC或毛细管柱HPLC中

活塞泵隔膜泵8.2.3主要部件高压输液泵

要求：密封性好，输出流量恒定，压力平稳，可调流量范围宽，耐腐蚀。分类：恒流泵（机械泵）恒压泵08-高效液相色谱法218.2.3主要部件1.高压输液系统马达往复式拉动密封溶剂球阀脉动阻尼器到色谱柱机械往复柱塞泵示意图08-高效液相色谱法22在分离过程中使用两种或两种以上不同极性的溶剂按一定程序连续改变它们之间的比例，使流动相的强度、极性、pH或离子强度发生变化，从而改变被测组分的相对保留值，提高分离效率。作用类似于气相色谱中的程序升温。8.2.3主要部件2.梯度淋洗装置08-高效液相色谱法23外梯度（高压梯度）:

利用两台高压输液泵，将两种不同极性的溶剂按一定的比例送入梯度混合室，混合后进入色谱柱。8.2.3主要部件8.2.3主要部件08-高效液相色谱法24内梯度（低压梯度）:

一台高压泵,通过比例调节阀,将两种或多种不同极性的溶剂按一定的比例抽入高压泵中混合。8.2.3主要部件8.2.3主要部件08-高效液相色谱法253.进样系统8.2.3主要部件

直接注射进样：操作方便，可获得高的柱效，但不能承受高压；进样方式

停留进样：高压泵停止供液，体系压力下降时，将样品直接加入到柱头。此法操作不便，重现性差，不得已才用；

高压六通阀进样：进样量的可变范围大，耐高压，易于自动化。但容易造成色谱峰柱前扩宽。它是目前普遍采用的进样方式。08-高效液相色谱法268.2.3主要部件高压六通阀进样08-高效液相色谱法278.2.3主要部件柱体为直型不锈钢管，内径1～6mm，柱长5～40cm。

发展趋势是减小填料粒度和柱径以提高柱效。4.色谱柱08-高效液相色谱法288.2.3主要部件（1）紫外检测器5.检测器

应用最广，对大部分有机化合物有响应。

对流动相的流速和温度变化不敏感；

流通池可做的很小（1mm

10mm，容积8

L）；

线形范围宽；

灵敏度高；

波长可选，易于操作；

可用于梯度洗脱。08-高效液相色谱法298.2.3主要部件（1）紫外检测器08-高效液相色谱法308.2.3主要部件（2）光电二极管阵列检测器1024个二极管阵列，分别检测特定波长，经计算机快速处理，得到三维立体谱图紫外检测器的重要进展08-高效液相色谱法318.2.3主要部件08-高效液相色谱法328.2.3主要部件（3）示差折光检测器

除紫外检测器之外应用最多的检测器；是一种通用型检测器（每种物质具有不同的折光指数）；

可连续检测参比池和样品池中流动相之间的折光指数差值。差值与浓度呈正比；

灵敏度低、对温度敏感、不能用于梯度洗脱；

有偏转式、反射式和干涉型三种；08-高效液相色谱法33光源调零光学零参比样品平面镜透镜光电转换记录仪放大器遮光板原理：利用两束相同角度的光照射溶剂相和样品+溶剂相，利用二者对光的折射率不同，其中一束（通常是通过样品+溶剂相）光因为发生偏转造成两束光的强度差发生变化，将此差示信号放大并记录，该信号代表样品的浓度。08-高效液相色谱法348.2.3主要部件

高灵敏度、高选择性；

对多环芳烃，维生素B、黄曲霉素、卟啉类化合物、农药、药物、氨基酸、甾类化合物等有响应；（4）荧光检测器08-高效液相色谱法358.3主要分离类型和原理8.3.1液-固吸附色谱8.3.2液-液分配色谱8.3.3离子交换色谱和离子色谱8.3.4尺寸排阻色谱8.3.5亲和色谱08-高效液相色谱法368.3.1液－固吸附色谱

基本原理：组分在固定相吸附剂上的吸附与解吸

适用对象：分离相对分子质量中等的油溶性试样，对具有官能团的化合物和异构体有较高选择性；08-高效液相色谱法37（1）.类型

硅胶

氧化铝

分子筛

聚酰胺（2）.结构

全多孔型

薄壳型5～10μm（3）.粒度

固定相：固体吸附剂，较常使用的是5～10μm的硅胶吸附剂；08-高效液相色谱法388.3.1液－固吸附色谱

液固吸附色谱的流动相：各种不同极性的一元或多元溶剂。

缺点：非线形等温吸附常引起峰的拖尾

流动相：液相色谱的流动相又称为：淋洗液，洗脱剂。流动相的组成、极性改变，可显著改变组分分离状况。选择原则：极性大试样—极性较强溶剂；

极性小试样—弱极性溶剂。08-高效液相色谱法39基本原理：组分在固定相和流动相上的分配。

(相对溶解度的差异)

流动相：

亲水性固定液，采用疏水性流动相，即流动相的极性小于固定液的极性(正相

normalphase)，反之流动相的极性大于固定液的极性(反相

reversephase)。

正相与反相的出峰顺序相反。8.3.2液－液分配色谱08-高效液相色谱法40正、反相色谱中极性和保留时间的关系待测物极性：A>B>C8.3.2液－液分配色谱08-高效液相色谱法41（1）.全多孔型担体

由氧化硅、氧化铝、硅藻土等制成的多孔球体；

早期采用100μm的大颗粒，表面涂渍固定液，性能不佳已不多见；

现采用10μm以下的小颗粒，化学键合制备柱填料；固定相8.3.2液－液分配色谱08-高效液相色谱法42

（2）.表面多孔型担体

（薄壳型微珠担体）

30～40μm的玻璃微球，表面附着一层厚度为1～2μm的多孔硅胶。表面积小，柱容量低。8.3.2液－液分配色谱08-高效液相色谱法43（3）.化学键合固定相

硅氧碳键型：≡Si—O—C

硅氧硅碳键型：≡Si—O—Si—C

硅碳键型：≡Si—C

硅氮键型：≡Si—N类型：8.3.2液－液分配色谱08-高效液相色谱法44

传质快，表面无深凹陷，比一般液体固定相传质快；

寿命长，化学键合，无固定液流失，耐流动相冲击；耐水、耐光、耐有机溶剂，稳定；

选择性好，可键合不同官能团，提高选择性；

有利于梯度洗脱；特点：8.3.2液－液分配色谱08-高效液相色谱法45分离机制（由键合基团的覆盖率决定）

高覆盖率：分配为主；

低覆盖率：吸附为主；8.3.2液－液分配色谱

适用对象：正相色谱法适用于极性化合物的分离；反相色谱法适用于非极性化合物的分离。08-高效液相色谱法468.3.3离子交换色谱

基本原理：

组分在固定相上发生反复离子交换反应；组分与离子交换剂之间亲和力的大小与离子半径、电荷、存在形式等有关。亲和力大，保留时间长；阳离子交换：R—SO3H+M+=R—SO3M+H+；

阴离子交换：R—NR4OH+X-=R—NR4X+OH-08-高效液相色谱法478.3.3离子交换色谱

流动相：

阴离子交换树脂作固定相，采用酸性水溶液；

阳离子交换树脂作固定相，采用碱性水溶液；

应用：

离子及可离解的化合物，氨基酸、核酸等。08-高效液相色谱法488.3.3离子交换色谱结构类别薄壳型离子交换树脂：薄壳玻璃珠为担体，表面涂约1%的离子交换树脂离子交换键合固定相：薄壳键合型；全多孔微粒硅胶键合型（键合离子交换基团）固定相：阴离子交换树脂（碱性）

或阳离子交换树脂（酸性）08-高效液相色谱法49

由离子交换色谱法派生出来。与离子交换色谱的区别：

8.3.4离子色谱法采用了特制的、具有极低交换容量的离子交换树脂作为柱填料，并采用淋洗液抑制技术和电导检测器，是测定混合阴离子的有效方法。08-高效液相色谱法508.3.4离子色谱法在离子交换分离柱后加一根抑制柱，降低流动相的电导

----抑制型离子色谱或双柱离子色谱采用电导率极低的溶液作流动相

----非抑制型离子色谱或单柱离子色谱08-高效液相色谱法518.3.5离子对色谱

原理：

将一种（或多种）与溶质离子电荷相反的离子加到流动相中，与溶质离子结合，形成疏水性离子对化合物，根据其吸附作用的不同在两相之间进行分配；

改变离子对试剂的浓度，可改变分离的选择性。应用：离子型或可离子化的化合物08-高效液相色谱法528.3.5离子对色谱

阴离子分离：常采用烷基铵类，如氢氧化四丁基铵或氢氧化十六烷基三甲铵作为对离子；

阳离子分离：常采用烷基磺酸类，如己烷磺酸钠作为对离子；

反相离子对色谱：非极性的疏水固定相(C-18柱)，含有对离子Y+的甲醇-水或乙腈-水作为流动相，试样离子X-进入流动相后，生成疏水性离子对Y+X-后；在两相间分配。08-高效液相色谱法538.3.5尺寸排阻色谱原理：按分子大小分离。小分子可以扩散到凝胶空隙，由其中通过，出峰最慢；中等分子只能通过部分凝胶空隙，中速通过；大分子被排斥在外，出峰最快；溶剂分子小，故在最后出峰。全部在死体积前出峰；

应用：

高聚物的分子量分布08-高效液相色谱法548.3.5尺寸排阻色谱固定相：

凝胶(具有一定大小孔隙分布)因此也称为凝胶色谱(1).软质凝胶葡聚糖凝胶、琼脂凝胶等多孔网状结构；水为流动相。适用于常压排阻分离。08-高效液相色谱法552.半硬质凝胶苯乙烯-二乙烯基苯交联共聚物，有机凝胶；非极性有机溶剂为流动相，不能用丙酮、乙醇等极性溶剂。3.硬质凝胶多孔硅胶、多孔玻珠等；孔径可控，具有恒定孔径和窄粒度分布。化学稳定性、热稳定性好、机械强度大，流动相性质影响小，可在较高流速下使用。8.3.5尺寸排阻色谱08-高效液相色谱法568.3.6亲和色谱

原理：利用生物大分子和固定相表面存在的某种特异性亲和力，进行选择性分离。

间隔基：

环氧、联胺等；配基：酶、抗原等；08-高效液相色谱法578.3.6亲和色谱这种固载化的配基将只能和具有亲和力特性吸附的生物大分子作用而被保留。改变淋洗液后洗脱。应用：

具有特殊亲和力的生物分子08-高效液相色谱法58类型主要分离机理主要分析对象或应用领域吸附色谱吸附能，氢键异构体分离、族分离，制备分配色谱疏水分配作用各种有机化合物的分离、分析与制备尺寸排阻色谱溶质分子大小高分子分离，分子量及其分布的测定离子交换色谱库仑力无机离子、有机离子分析离子排斥色谱Donnan膜平衡有机酸、氨基酸、醇、醛分析离子对色谱疏水分配作用离子性物质分析疏水作用色谱疏水分配作用蛋白质分离与纯化手性色谱立体效应手性异构体分离，药物纯化亲和色谱生化特异亲和力蛋白、酶、抗体分离，生物和医药分析HPLC按分离机理的分类

08-高效液相色谱法598.4高效液相色谱流动相1.流动相类别

按流动相组成分：单组分和多组分；按极性分：极性、弱极性、非极性；

按使用方式分：固定组成淋洗和梯度淋洗。

常用溶剂：己烷、四氯化碳、甲苯、乙酸乙酯、乙醇、乙腈、水。08-高效液相色谱法608.4高效液相色谱流动相3.流动相选择在选择溶剂时，溶剂的极性是选择的重要依据；

采用正相液-液分配分离时：首先选择中等极性溶剂，若组分的保留时间太短，降低溶剂极性，反之增加；也可在低极性溶剂中，逐渐增加其中的极性溶剂，使保留时间缩短。08-高效液相色谱法618.4高效液相色谱流动相

常用溶剂的极性顺序：水(最大)>甲酰胺>乙腈>甲醇>乙醇>丙醇>丙酮>二氧六环>四氢呋喃>甲乙酮>正丁醇>乙酸乙酯>乙醚>异丙醚>二氯甲烷>氯仿>溴乙烷>苯>四氯化碳>二硫化碳>环己烷>己烷>煤油(最小)08-高效液相色谱法628.4高效液相色谱流动相

采用二元或多元组合溶剂作为流动相可以灵活调节流动相的极性或增加选择性，以改进分离或调整出峰时间。——梯度淋洗08-高效液相色谱法638.4高效液相色谱流动相4.选择流动相时应注意的几个问题

尽量使用高纯度试剂作流动相，防止微量杂质长期累积损坏色谱柱和使检测器噪声增加。

化学惰性好，不与固定相发生作用而使柱效下降或损坏柱。如使固定液溶解流失；酸性溶剂破坏氧化铝固定相等。08-高效液相色谱法648.4高效液相色谱流动相

试样在流动相中应有适宜的溶解度，防止产生沉淀并在柱中沉积。

低黏度。黏度太大会降低样品组分的扩散系数，造成传质减慢，柱效下降，同时引起柱压升高。

流动相同时还应满足检测器的要求。如当使用紫外检测器时，流动相不应有紫外吸收。08-高效液相色谱法658.5影响分离的因素1.提高柱效的途径在高效液相色谱中，液体的扩散系数仅为气体的万分之一，则速率方程中的分子扩散项B/u较小，可以忽略不计，即：液相色谱H-u曲线与气相色谱的形状不同，如图所示：H=A+Cu08-高效液相色谱法66

液体的粘度比气体大一百倍，密度为气体的一千倍，故降低传质阻力是提高柱效主要途径。

由速率方程，降低固定相粒度可提高柱效。

液相色谱中，不可能通过增加柱温来改善传质。一般采用恒温。

改变淋洗液组成、极性是改善分离的最直接的因素。P282-2848.5

影响分离的因素08-高效液相色谱法678.5影响分离的因素2.流速对分离的影响但在实际操作中，流量仍是一个调整分离度和出峰时间的重要可选择参数。流速大于0.5cm/s时,H～u曲线是一段斜率不大的直线。降低流速，柱效提高不是很大。08-高效液相色谱法688.5影响分离的因素3.固定相和色谱柱的影响气相色谱中的固定液原则上都可以用于液相色谱，其选用原则与气相色谱一样。

但在高效液相色谱中，分离柱的制备是一项技术要求非常高的工作，一般很少自行制备。08-高效液相色谱法698.6分离类型的选择1.根据相对分子质量选择

相对分子质量非常低的样品，其挥发性好，适用于气相色谱。

标准液相色谱类型（液-固、液-液、及离子交换色谱）最适合的相对分子质量范围是200-2000。

对于相对分子质量大于2000的样品，则用尺寸排阻法为最佳。08-高效液相色谱法702.根据溶解度选择

弄清样品在水、异辛烷、苯、四氯化碳、异丙醇中的溶解度是很有用的。8.6分离类型的选择

如果样品可溶于水并属于能离解物质，以采用离子交换色谱为佳；

如样品可溶于烃类（如苯或异辛烷），则可采用液-固吸附色谱；08-高效液相色谱法712.根据溶解度选择8.6分离类型的选择

如样品溶解于四氯化碳，则多采用常规的分配和吸附色谱分离；

如样品既溶于水又溶于异丙醇时，常用水和异丙醇的混合液作液-液分配色谱的流动相，以憎水性化合物作固定相。08-高效液相色谱法728.6分离类型的选择3.根据分子结构选择

用红外光谱法预先简单地判断样品中存在什么官能团。然后确定采用什么方法合适。

酸、碱化合物用离子交换色谱；

脂肪或芳香族用液-液分配色谱、液一固吸附色谱；

异构体用