分子生物学实验讲义(2020版-)

PAGEPAGE8《分子生物学》实验讲义实验一分子生物学实验基础知识及常用仪器介绍实验二质粒DNA分离纯化实验三琼脂糖凝胶电泳实验四聚合酶链反应(PCR)检测质粒DNA实验五限制酶切鉴定质粒DNA实验一分子生物学实验基础知识及常用仪器介绍一、实验目的了解分子生物学实验特点，了解分子生物学实验室常用设备及基本实验操作。二、实验内容分子生物学实验知识⑴严格操作规程分子生物学实验一般比较复杂，如所用试剂多、操作步骤多、实验时间长等，因此为保证实验效果，在实验室中一定要有整体观念，严格按照操作规程进行。⑵耐心细致操作实验中不能急于求成，特别是对于初入门者，应反复操作，积累经验。⑶习惯微量操作在分子生物学实验中，试剂的用量往往很少，常常细到1ul液体、ug或ng固体，这是平常肉眼很难看到的，所以刚刚接触实验的人往往感到不习惯，总是担心要取的东西能否看到、准不准确，操作的样品会不会丢失，总是想加大反应体积，以为越多越好。这些观念都是错误的。只有定时定量加入液体，才能保证实验成功，所以平时应加以练习，逐渐建立微量操作的观念才能解决好问题。⑷防止实验污染分子生物学实验的对象主要是核酸，不同生物材料的DNA和DNA之间，不同的样品之间，核酸酶等蛋白酶与核酸之间，产物与反应物之间都有可能造成污染，最终导致实验的失败。故要从所用试剂、仪器设备、耗材及操作人员等方面进行防止污染的操作。⑸正确处理试剂分子生物学实验中对试剂的要求十分严格，包括试剂的等级、配制、除菌储备等各方面均有严格要求。⑹注意实验安全分子生物学实验中，操作者常会接触一些对人体有害的试剂，必须实验安全要求进行实验操作，否则会给实验室甚至整个人类带来巨大的危害。分子生物学实验常用仪器介绍⑴微量取液器⑵水纯化装置（离子交换器、超纯水装置）⑶离心机（低速、高速、超速）⑷电泳装置（电泳仪、电泳槽）⑸灭菌设备（高压蒸汽灭菌锅、过滤除菌器）⑹超净工作台⑺PCR仪⑻凝胶成像系统（紫外分析仪、核酸凝胶电泳图谱的记录）⑼温度控制设备（冷冻设备、培养箱、水浴箱、烤箱）⑽其它设备（紫外可见分光光度计、微波炉、凝胶干燥器、真空干燥仪）分子生物学基本实验操作⑴基因组DNA的分离与纯化（核酸浓度和纯度测定）⑵真核细胞mRNA的分离与纯化⑶质粒DNA的提取⑷PCR基因扩增实验⑸限制性内切酶酶切实验⑹DNA重组技术⑺DNA转移技术⑻DNA测序：化学法、双脱氧链终止法⑼核酸探针的制备技术：末端标记、PCR法制探针、非放射性探针⑽分子杂交技术：Southern印迹、Northern印迹和Western印迹微量移液器的使用可调节微量移液器标准操作程序（适用的液体：水、缓冲液、稀释的盐溶液和酸碱溶液）：⑴调节数字至所需体积；⑵装上吸嘴（不同规格的移液器用不同的吸头），注意气密性）；⑶按到第一档，垂直进入液面几毫米；⑷缓慢松开控制按钮（否则液体进入吸头过速会导致液体倒吸入移液器内部吸入体积减少）；⑸停顿1s后将吸嘴提离开液面；⑹平稳按压打出液体。注意吸嘴一般要贴壁并有一定角度，先按到第一档，稍微停顿1s后，待剩余液体聚集后，再按到第二档将剩余液体全部压出。⑺按吸嘴弹射按钮除去吸嘴；⑻将量程调至最大量程处。常见的错误操作：⑴吸液时，移液器本身倾斜，导致移液不准确(应该垂直吸液，慢吸慢放)。

⑵装配吸头时，用力过猛，导致吸头难以脱卸(无需用力过猛，选择与移液器匹配的吸头)。

⑶平放带有残余液体吸头的移液器(应将移液器挂在移液器架上)。

⑷用大量程的移液器移取小体积样品(应该选择合适量程范围的移液器)。

⑸直接按到第二档吸液(应该按照上述标准方法操作)。

⑹使用丙酮或强腐蚀性的液体清洗移液器(应该参照正确清洗方法操作)。三、作业1.谈一谈微量移液器的使用方法及注意事项。实验二碱裂解法制备质粒DNA一、实验目的掌握碱裂解法提取质粒DNA的原理与方法。了解碱裂解法中各种试剂的作用。二、实验原理基于染色体DNA与质粒DNA之间变性与复性的差异而达到分离质粒DNA的目的，因为①染色体DNA分子量比质粒DNA大得多；②从细胞中提取到的染色体DNA大多断裂成线状分子,而质粒DNA却是共价闭合环状结构。在pH高达12.6的条件下，染色体DNA的氢键断裂，双螺旋结构解开变性，同时由于受到机械剪切力或核酸酶等的作用,染色体DNA易被切成大小不同的片段；而闭环质粒DNA链氢键虽也断裂，但因其超螺旋共价闭合环状结构，两条互补链不会完全分离。当以pH4.8的醋酸钾高盐缓冲液调节pH至中性时，质粒DNA又恢复其天然构象，以可溶状态存在于液相中，而染色体DNA不能复性而形成不溶性网状结构，与不稳定的大分子RNA、变性的蛋白质-SDS复合物以及细菌碎片等一起形成絮状沉淀而被除去。然后用无水乙醇沉淀质粒DNA，即可得到纯化的质粒DNA。三、实验材料生物材料大肠杆菌JM109菌株；pCAGGS重组质粒，本实验所用重组质粒是在pCAGGS质粒的多克隆位点上选择KpnI和NheI酶双切后插入了一个300bp的外源DNA片段。下图(图1)是质粒pCAGGS图谱。图1.质粒pCAGGS图谱主要试剂用于细菌培养：LB固体培养基，LB液体培养基，氨苄青霉素（100mg/mL）。用于质粒DNA提取：溶液P1(BufferP1)：使用前按照TIANRed:溶液P1=1:200进行混合，彻底颠倒混匀，混匀后的溶液为澄清的红色。溶液P2(BufferP2)：无色；溶液P5(BufferP5)：无色；漂洗液PWT(BufferPWT)：使用前与无水乙醇混合；洗脱缓冲液TB(BufferTB)：可用双蒸水代替；RNaseA(10mg/ml)、TIANRed：溶液P1在使用前先加入RNaseA和TIANRed，置于2-8℃保存。主要仪器微量移液器，超净工作台，制冰机，高速离心机，冰箱等。四、实验方法培养细菌：将含有pCAGGS重组质粒的JM109菌株大肠杆菌涂布于加有氨苄青霉素（终浓度为100μg/mL）的LB平板，37℃下静置培养12-16h；挑取单菌落于10mL含氨苄青霉素（终浓度为100μg/mL）的LB液体培养基（50ml-三角瓶）中，37℃，220rpm培养过夜。取1.5mL菌液于1.5mL离心管中，12000g离心1min，用微量移液器弃尽上清。【注意】①本实验中所使用的离心管和移液枪头必须经过灭菌处理。②如果菌量过少，可再取1.5mL菌液于1.5mL离心管中，重复操作一次。【现象】离心管底部有少量白色沉淀，上部为澄清液体。向留有菌体沉淀的离心管中加入150μl溶液P1，使用移液器或涡旋振荡器彻底悬浮细菌沉淀。【注意】操作相对剧烈，以彻底打匀沉淀或碎块。【现象】溶液为均匀浑浊的红色向离心管中加入150μl溶液P2，温和地上下翻转6-8次使菌体充分裂解。【注意】温和地混合，不要剧烈震荡，以免污染基因组DNA【现象】澄清的紫色。若混杂有浑浊的红色，则说明裂解不充分，继续混匀直至溶液颜色完全变为澄清的紫色。向离心管中加入350μl溶液P5,立即快速地上下颠倒混匀12-20次，充分混匀，此时将出现絮状沉淀。【注意】加入溶液P5后应立即混合，应快速上下颠倒混匀，避免产生局部沉淀。【现象】溶液为澄清的黄色，如果在黄色中混有紫色，则说明复性不充分，继续混匀至溶液颜色完全变为澄清的黄色。12000rpm(~13,400xg)离心2min，将上清液用移液器转移到吸附柱CP3中(吸附柱放入收集管中)，注意尽量不要吸出沉淀。12000rpm离心30sec,倒掉收集管中的废液，将吸附柱CP3重新放入收集管中。【注意】尽量不要吸到白色杂质，否则会影响质粒的纯度。向吸附柱CP3中加入300μl漂洗液PWT(已加入无水乙醇)，12000rpm离心30sec,倒掉收集管中的废液，将吸附柱CP3放入收集管中。12000rpm离心1min,倒掉收集管中的废液，目的是将吸附柱中残余的漂洗液去除。将吸附柱CP3置于一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位滴加50-100μl洗脱缓冲液或灭菌双蒸水，12000rpm离心30sec，将质粒溶液收集到离心管中。五、结果与讨论作为载体，质粒DNA上有哪些元件？本实验中，溶液P1、溶液P2、溶液P5的作用分别是什么？请分析出现下列现象的原因及解决办法：①加入溶液P2后溶液并不澄清；②加入溶液P5后溶液中仍然呈现紫色；③加入溶液P5并离心后，上清中存在大量微小白色沉淀。实验三琼脂糖凝胶电泳检测DNA一、实验目的掌握琼脂糖凝胶电泳的原理和基本操作技术。二、实验原理DNA分子在高于其等电点（pI）pH值的溶液中带负电荷，在直流电场中向正极泳动。不同的DNA分子因所带电荷、构象和分子量大小不同，在同一电泳系统中的迁移速度存在差异，因而可以使核酸片段彼此分离，并检测其分子大小。凝胶中混入适量荧光染料（如溴化乙锭EB，或者GelRed），染料(EB)分子可嵌入DNA分子碱基之间，在紫外线照射下发出荧光，可观察到核酸片段在凝胶中的位置和亮度，从而对DNA进行定性或定量测定。琼脂糖凝胶的浓度可根据DNA分子的大小来确定，一般基因组DNA可用0.8%琼脂糖凝胶进行电泳检测，质粒DNA选择1.2％琼脂糖凝胶，而对只有几百个碱基对的寡核苷酸可制备浓度更高一些的琼脂糖凝胶。三、实验材料材料：实验二所提取的质粒DNA；试剂：0.5×TBE(或1×TAE)，6×上样缓冲液，溴化乙锭(简称EB，配制成10mg/ml,用铝箔或黑纸包裹容器,室温储存，有毒！不可徒手接触）或GelRed核酸染料，琼脂糖粉；主要仪器：微量移液器，电泳槽，制胶板，电泳仪，凝胶成像系统。四、实验方法取制胶槽，洗净、晾干、安装好。【注意】胶槽水平放置，向下压实，防止漏胶。器具会接触到EB，不可徒手操作！灌胶：将100ml熔化的琼脂糖凝胶（1.2%）冷却至约65℃时，加10ulEB（或GelRed核酸染料，此类荧光染料的使用说明书上常要求按1:10000比例添加）混匀，小心地将凝胶倒入胶槽上，控制灌胶速度，使胶均匀展开，直到整个制胶槽表面形成均匀的凝胶层，凝胶厚度一般为3~5mm。将梳子插入到胶槽的定位槽中。【注意】尽量避免凝胶中产生气泡；器具会接触到溴化乙锭，不可徒手操作！！！室温下待凝胶凝固完全后，取出梳子，将胶放在电泳槽中，加入0.5×TBE(或1×TAE)电泳缓冲液，液面高于凝胶面约1mm。【注意】点样孔一端靠近负极；器具会接触到溴化乙锭，不可徒手操作！！！加样将实验所得的质粒DNA作为电泳样品。将样品与上样缓冲液6：1混匀，用微量加样器将样品分别加入胶板的样品小槽内，同时留一孔点入Marker。【注意】加样时应防止加样器头碰坏或插穿凝胶孔。加样完毕后，盖好电泳槽，接通电源，开始电泳。为防止样品扩散，在样品进胶前可用略高电压。当样品进胶后，应控制电压不高于5V/cm。当染料条带移动到距离凝胶前沿1cm时，停止电泳。【注意】通电后片刻检查通电情况。观察小心取出凝胶，将凝胶放在凝胶成像系统中进行观察。【注意】器具会接触到溴化乙锭，不可徒手操作！！！结果分析：凝胶中DNA存在的位置呈现橘红色荧光，可观察到清晰的条带。五、结果与讨论电泳检测实验中提取的质粒，绘出电泳图并作说明。实验四聚合酶链反应(PCR)技术体外扩增DNA一、实验目的熟悉PCR反应的基本原理；掌握PCR反应的操作方法。二、实验原理聚合酶链反应（polymerasechainreaction，PCR）是体外酶促合成位于两段已知序列（，引物）之间的DNA片段的一种技术。利用PCR技术可在短时间之内大量扩增目的基因或DNA片段，以用于基因工程操作。PCR的基本条件：⑴DNA模板（在RT-PCR中模板是RNA）；⑵引物；⑶dNTP（dATP、dTTP、dGTP、dCTP）⑷TaqDNA聚合酶PCR循环由三个步骤组成：⑴变性使模板DNA解离成单链；⑵退火使引物与模板DNA所需扩增序列两端结合；⑶延伸DNA聚合酶利用dNTP合成与模板碱基序列互补的DNA链。每一个循环的产物可作为下一个循环的模板，通过30个左右循环后，目的片段的扩增可达106倍。本实验中模板为pCAGGS重组质粒，以其插入的外源DNA片段（300bp）两端设计特异性引物进行PCR扩增，产物长度为300bp，以此鉴定重组质粒。三、实验材料材料pCAGGS重组质粒，作为PCR扩增的模板。试剂PCRmix试剂（含Taq酶、10×反应缓冲液、25mmol/LMgCl2、dNT。

引物P1、P2（P1为上游引物F-PC01，P2为下游引物R-PC02）。GelRed核酸染料：此类荧光染料的使用说明书上常要求按1:10000比例添加；或溴化乙啶染色液(EB)：10mg/ml（EB具致癌作用，使用时务必小心）。上样缓冲液Loadingbuffer（10×）：0.25%溴酚蓝，40%甘油。主要仪器PCR扩增仪、电泳仪、台式离心机、

恒温水浴、凝胶成像系统等。四、实验方法PCR扩增20ul反应体系，按下表(表1)加入试剂，并小心混匀。另加入石蜡油20ul(根据实验需要和个人操作习惯决定是否加入石蜡油)。【注意】务必使DNA模板加入下层水相混匀，点离！！！表1.PCR反应体系配制表(20uL)试剂体积ddH2O8.4ul2×PCRmix10ulP1（10μM）0.3ulP2（10μM）0.3ulDNA模板1ul⑵设置PCR程序：94℃，3min；94℃（30s）→55℃（30s）→72℃（30s），30循环；72℃，5min；⑶运行PCR程序PCR产物鉴定反应结束后，取5ulPCR产物进行1.2%琼脂糖电泳分析。【注意】从下层水相取样。五、结果与讨论绘制PCR产物电泳示意图，标明各条带的分子量并对所测样品进行结果判定。实验五DNA的限制性酶切反应实验目的1．掌握限制性核酸内切酶的特点。2．掌握重组质粒的酶切鉴定原理，及酶切结果的分析方法。实验原理限制性核酸内切酶是一类能识别双链DNA中特定碱基序列并在该序列内部或附近切割DNA的一类核酸水解酶。根据酶的识别切割特性、催化条件及是否具有修饰酶活性，可分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型三大类。通常所指的DNA限制性核酸内切酶就是Ⅱ型酶。限制性内切酶在分子生物学研究中得到了广泛应用，是重组DNA的基础，DNA经限制酶切后产生的酶切图谱是常用的鉴定DNA序列的方法。本实验根据重组质粒的克隆位点，选用KpnI和NheI双酶切鉴定提取的质粒DNA，电泳后应该获得4.7kb和0.3kb两个条带。限制性内切酶消化中常见的问题和原因。1．DNA完全没有被限制性内切酶切割：①限制性内切酶失活；②DNA不纯，含有SDS、有机溶剂、EDTA等；③非限制性内切酶最佳反应条件；④酶切位点被修饰；⑤DNA上不存在该酶的识别顺序。2．DNA切割不完全：①限制性内切酶活性下降或稀释不正确；②DNA不纯或反应条件不佳；③酶切位点被修饰；④部分DNA溶液粘在管