GENE-ENGINEERING基因重组与基因工程

基因重组与基因工程

GeneticRecombination&GeneticEngineering

PauI

Berg(保罗.伯格)1973年发明重组DNA技术荣获1980年诺贝尔化学奖

台湾动物科技研究所2003年

中山大学实验动物中心陈系古教授2000年法国科学家，兔子“Alba”著译者:黄培堂

出版者：科学出版社

出版时间：2002.09

原著：J.萨姆布鲁克

D.W.拉塞尔定价：￥168.00

字数：2917千字

页数：1949页

中译本序/译者的话/第三版前言上册第1章质粒及其在分子克隆中的应用第2章λ噬菌体及其载体第3章M13噬菌体载体第4章高容量载体的应用第5章DNA凝胶电泳和脉冲场琼脂糖凝胶电泳第6章真核基因组DNA的制备和分析第7章真核mRNA的提取、纯化和分析第8章聚合酶链式反应体外扩增DNA第9章放射性标记DNA探针与RNA探针的制备第10章合成寡核苷酸探针第11章cDNA文库制备及其基因鉴定下册第12章DNA测序第13章诱变第14章表达文库的筛选第15章在大肠杆菌中表达克隆化基因第16章哺乳动物培养细胞中导入克隆化基因第17章哺乳动物培养细胞的基因表达分析第18章蛋白质相互作用研究技术附录1分子克隆中使用的缓冲液和试剂的配制附录2培养基附录3载体和细菌菌株附录4分子克隆所用的酶附录5酶的抑制物附录6核酸附录7密码子和氨基酸附录8分子克隆中的常用技术附录9检测系统附录10DNA陈列技术附录11生物信息学附录12告戒附录13供应商附录14商标索引引言第一节基因工程的基本程序第二节基因工程常用的工具酶第三节基因工程常用的载体第四节基因工程在医学和制药工业中的应用

目的要求：

1.掌握重组DNA和基因工程的基本概念；

2.掌握基因工程的基本程序;

3.熟悉基因工程在医学和制药工业中的应用；

4.了解基因工程常用的工具酶和载体。21世纪核心的科学技术：

现代生物技术(生物工程)

计算器微电子技术新材料新能源航天技术现代生物技术：

基因工程（核心技术）蛋白质工程酶工程细胞工程引言分子克隆(molecularcloning)DNA克隆(DNAcloning)基因克隆(genecloning)重组DNA(recombinantDNA)分子克隆技术(molecularcloningtechnique)DNA克隆技术(DNAcloningtechnique)基因克隆技术(genecloningtechnique)重组DNA技术(recombinantDNAtechnique)

基因工程(geneengineering)引言重组DNA(recombinantDNA)：

就是对不同生物的遗传物质——目的基因，在体外使用一种工具酶，用人工的方法，进行“剪切”、“组合”、“拼接”，使遗传物质按照我们的意愿重新组合，然后通过运载物质（质粒、噬菌体、病毒等）转入微生物体内或动、植物细胞内（统称载体），进行无性繁殖，并使我们需要的基因在细胞中表达出来，产生出我们所需要的产物或组成新的生物类型。引言

重组DNA是指将一种生物体（供体）的基因与载体在体外进行拼接重组，然后转入另一种生物体（受体）内，使之按照人们的意愿稳定遗传并表达出新产物或新性状的DNA体外操作程序。基因工程(geneengineering):

是指重组DNA的产业化设计与应用，包括上游和下游两大组成部分。上游部分指的是基因重组、克隆和表达的设计与构建（即重组DNA）；而下游部分则涉及到基因工程菌或细胞的大规模培养以及基因产物的分离纯化过程。

实现重组DNA所采用的方法及相关的工艺统称基因工程。

理论基础：①不同基因具有相同的物质基础；②基因是可切割的；③基因是可以转移的；④多肽和基因之间存在对应关系；⑤遗传密码是通用的；⑥基因可以通过复制把遗传信息传给下一代。历史：1973Cohen第一例成功的克隆实验1978Genentech公司人胰岛素世界上第一种基因工程蛋白药物

1982第一个基因工程药物--重组人胰岛素在英、美获准使用

1985第一批转基因家畜（兔、猪和羊），

中国转基因鱼

1993基因工程西红柿在美国上市1997英国罗斯林研究所多莉羊1999.9中国获准加入人类基因组计划.负责测定人类基因组全部序列的1%2000.6.26科学家公布人类基因组工作草图2001.2.11公布人类基因组基本信息胰岛素人生长激素干扰素白细胞介素2粒细胞集落刺激因子粒细胞巨噬细胞集落刺激因子红细胞生成素EPO组织纤溶酶原激活剂生长激素促生长素抗血友病因子Ⅷ脱氧核糖核酸酶葡糖脑苷脂酶鼠单克隆抗体体内-体外第一节基因工程的基本程序获得目的基因和载体；目的基因和载体的连接(体外重组)；连接产物(重组体)导入宿主细胞；重组体的扩增、筛选；目的基因在细胞中的表达、分离、纯化、鉴定等。载体目的片断酶切酶切重组体连接导入细胞筛选扩增、表达、纯化等获得目的基因和载体——切目的基因和载体的连接(体外重组)——接连接产物(重组体)导入宿主细胞——转重组体的扩增、筛选——筛目的基因在细胞的表达、分离、纯化、鉴定等。一、目的基因的获得1、化学合成法

要求：已知目的基因的核苷酸序列或其产物的氨基酸序列。

局限性：短片段、简并性、高费用2、基因组DNA文库(genomicDNAlibrary)

存在于转化细胞内由克隆载体所携带的所有基因组DNA的集合。组织或细胞染色体DNA基因片断克隆载体重组DNA分子含重组分子的转化菌限制性内切酶受体菌

3、cDNA文库：

以mRNA为模板，利用反转录酶合成与mRNA互补的DNA，再复制成双链cDNA片段，与适当载体连接后转入受体菌，即获得cDNA文库(cDNAlibrary)。组织或培养细胞载体mRNAcDNAcDNA与载体连接导入大肠杆菌鉴定cDNA文库的克隆数与特征4、PCR方法获取：二、重组DNA导入受体细胞感受态：指受体(或者宿主)处于最易接受外源DNA片段并实现其转化的一种生理状态。将宿主菌在LB平板上划线，37℃培养16-20h。挑取单菌落转入20mlLB培养基锥瓶中，37℃振荡过夜。从中取2ml菌液转入50mlLB培养基中37℃振荡培养4-5h，测OD600达0.4-0.5。培养物于冰上10min。转入50ml离心管，于4000rpm下4℃离心10min。弃上清，倒置离心管1min，流尽剩余残液然后加入10ml冰预冷的0.1MCaCl2，置冰上10min。4000rpm4℃离心10min，弃上清。加入2ml，0.1MCaCl2悬浮细胞，于4℃过夜。#感受态细胞制备转化(transformation)：在基因克隆技术中，转化特指将质粒DNA或以其为载体构建的重组DNA导入细菌体内，使之获得新遗传特性的一种方法。转染(transfection):

指病毒或以它为载体构建的重组子导入真核细胞的过程。感染(infection):

以噬菌体、粘性质粒和真核细胞病毒为载体的重组DNA分子，在体外经过包装成具有感染能力的病毒或噬菌体颗粒，才能感染适当的细胞，并在细胞内扩增。转导(transduction):

指以噬菌体为载体，在细菌之间转移DNA的过程，有时也指在真核细胞之间通过逆转录病毒转移和获得细胞DNA的过程。

1.重组体导入大肠杆菌

（1）氯化钙法（2）电穿孔法(electroporation)

（3）病毒感染法/体外包装法#氯化钙转化法在1.5mlEppendorf管中加入200μl感受态细胞和10μl40ngDNA溶液，温和混匀，于冰上30min。于42℃水浴90S。冰浴2min。加入800μlLB液体培养基37℃45min。取200μl涂布于含Amp(50μg/ml)琼脂糖平皿，37℃培养12-16h，观察结果。#电穿孔法DNAMovement2.重组体导入哺乳动物细胞

（1）磷酸钙共沉淀法

（2）脂质体介导法：人工细胞膜（3）病毒感染法（4）显微注射法三、

DNA重组体的筛选与鉴定1.根据重组载体的表型进行筛选普通抗菌素平板筛选：插入失活筛选：

α-互补——蓝-白斑筛选：含LacZ基因（编码β半乳糖苷酶）该酶能分解生色底物X-gal(5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷)产生蓝色，从而使菌株变蓝。当外源DNA插入后，LacZ基因不能表达，菌株呈白色，以此来筛选重组细菌。称之为蓝-白斑筛选。IPTG;X-gal(5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷)

2.DNA限制酶切图谱分析

bp—1534—994—

695—515—377—237

ABCM

3.PCR鉴定4.利用核酸杂交和放射自显影进行鉴定

★基因工程的基本程序获得目的基因和载体——切目的基因和载体的连接(体外重组)——接连接产物(重组体)导入宿主细胞——转重组体的扩增、筛选——筛目的基因在细胞的表达、分离、纯化、鉴定等。基因工程技术策略分：

基因载体

目的基因

质粒噬菌体病毒直接分离cDNA

人工合成基因文库切：

限制性内切酶有缺口的载体目的基因接：

连接酶粘端连接平端连接尾接法重组体转：转化转染体外包装带重组体的宿主筛：表型筛选电泳法核酸杂交第二节基因工程常用的工具酶工具酶

活性限制性核酸内切酶

识别特异序列，切割DNA连接酶

催化5'-磷酸与3'-羟基形成磷酸二酯键DNA聚合酶

以DNA为模板合成DNARNA聚合酶(逆转录酶)

以RNA为模板合成DNA碱性磷酸酶

切除末端磷酸T4多聚核苷酸激酶

催化核酸5'-羟基磷酸化末端脱氧核苷酸转移酶

催化3'-端合成同聚体尾一、限制性核酸内切酶概念：是由细菌产生的一种能识别双链DNA中的特定序列，并以内切方式水解核酸链中磷酸二酯键的核酸内切酶，又叫切割酶或限制酶。分类：Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型。以Ⅱ型为主。命名原则：常用限制性内切酶的种类：#识别和切割位点：

5‘粘性末端：

5‘-GAATTC-3’

5’-G

AATTC-3’

3‘-CTTAAG-5’

3’-CTTAA

G-5’3‘粘性末端：

平端或钝端：EcoRⅠ+二、连接酶与连接连接方式：

三、DNA聚合酶分类：

DNA聚合酶ⅠDNA聚合酶大片段（Klenow片段）

TaqDNA聚合酶TaqDNA聚合酶：耐受高温，70-75℃时具有最佳的生物活性。主要用于PCR。四、RNA聚合酶(逆转录酶)作用：

RT-PCR

RNADNA

第三节基因工程常用的载体载体(vector)：

装载目的基因的工具。

本质是DNA。分类：克隆载体；表达载体。常用的载体：

质粒(plasmid)；

噬菌体(phage)；

酵母载体(yeastvector)；

病毒载体(virusvector)。质粒(plasmid)：

是细菌染色体以外的遗传物质，是环状闭合的双链DNA

质粒(plasmid)：

基本特征：复制起点启动子多克隆位点加尾信号筛选标记载体的选择标准(以质粒为例)：能自主复制；具有两个以上的遗传标记物，便于重组体的筛选和鉴定；有克隆位点(外源DNA插入点)，常具有多个单一酶切位点，称为多克隆位点；分子量小，以容纳较大的外源DNA。作用：装载小于2kb的目的DNA质粒(plasmid)：

2.噬菌体(phage)：

感染细菌的病毒称为噬菌体。

作用：装载大片断DNA，从6-8kb、

10-20kb、30-45kb不等吸附吸附是噬菌体与菌体表面受体发生特异性结合的过程，其特异性取决于噬菌体蛋白与宿主菌表面受体分子结构的互补性。毒性噬菌体的复制周期—溶菌性周期3.酵母载体(yeastvector)：

酵母人工染色体(yeastartificialchromosome,YAC)：可接受2Mb的外源

DNA插入，是人类

基因组计划物理图

普绘制采用的主要载体。4.病毒载体(virusvector):

作用：在真核细胞或者哺乳动物细胞中表达外源基因。种类：

昆虫杆状病毒载体；

SV40病毒载体；逆转录病毒载体；

腺病毒载体；

痘苗病毒载体等。第四节基因工程

在医学和制药工业中的应用一、医学基础研究★当今人类疾病的发展趋势：

★研究疾病的分子机制：

二、基因诊断

1.基因探针——基因水平的诊断：

亲子鉴定：“爆棚”现象

产前诊断：

个人基因信息身份证：

2.抗原或者抗体——蛋白质水平：乙肝核心抗原/e抗原：三、基因治疗1.基因治疗的概念

狭义指将具有正常功能的基因置换或者增补体内缺陷的基因，从而达到治病的目的。

广义指将某遗传物质转移到患者体内，使其在体内表达，最终达到治疗某种疾病的方法，均谓之基因治疗。2.基因治疗的方式基因修复/矫正(genecorrection)基因置换(genereplacement)基因增补/修饰(geneaugmentation)基因失活(geneinactivation)：

RNA干扰(RNAinterference,RNAi)

基因敲除(geneknock-out)自杀基因(suicidegene)

单纯疱疹病毒胸苷激酶基因HSV-

tk(丙氧鸟苷GCV-磷酸化GCV)1990年，美国科学家成功治愈了患有严重复合型免疫缺陷疾病(SCID)(腺苷酸脱氨酶缺陷)的4岁女孩艾姗蒂。用基因治疗血友病四、转基因动物

GFP

我国培养的转基因兔，转入的乙型肝炎表面抗原基因已在基因兔体内整合并表达。

兔研人员将乙型肝炎表面抗原基因注入兔受精卵的情形。美国通过基因工程将人的基因植入牛的体内，由转基因公牛受精的母牛产下5头健壮的牛犊，每头都含有一个人类的基因。

1998年，中国人-曹谊林在美国麻省大学查里斯•文森提(CharlesVacanti)的实验室创造该奇迹。

中科院水生生物研究所培育的转基因鲤鱼，表现出快速生长效应。五、生物制药(包括疫苗和抗体)为什么？

随心所欲

低成本剧增效应等我国第一个实现产业化的生物高技术产品，人α型基因工程干扰素。1309元/支，14支/盒，21天1个疗程世界生物技术药品市场：世界生物技术药品市场：1——1996年；2——1997年；3——2000年；4——2003年。中国生物技术药品市场：截至目前，我国