《微生物发酵技术》-项目四 发酵工业的无菌操作

发酵工业常用灭菌方法项目四发酵工业的无菌操作课程导入加热灭菌法辐射灭菌法过滤除菌法化学药品灭菌法一、加热灭菌法微生物细胞有蛋白质组成，加热使蛋白变性，从而达到消除微生物的作用。加热灭菌法干热灭菌法湿热灭菌法火焰灭菌法干热灭菌煮沸灭菌法巴氏消毒法间歇灭菌法高压蒸汽灭菌法一、加热灭菌法（一）干热灭菌法原理:应用：可使细胞膜破坏，蛋白质变性和原生质干燥，并可使各种细胞成分发生氧化变质。a.干热灭菌器（160～170℃，1～1.5h）。b.火焰灭菌（接种针、玻璃棒、三角瓶口等的灭菌）。一、加热灭菌法（二）湿热灭菌法煮沸灭菌法将要消毒的物品放入水中煮沸（100℃）15～20min，一般微生物的营养细胞都可以杀死，但不能杀死芽孢。巴氏消毒法较低温消毒法，加热到70℃左右，维持30分钟，以杀死不耐高温的物质中的微生物和病原体的消毒法。牛奶、啤酒、黄酒、酱油和醋等用此法消毒。一、加热灭菌法间歇灭菌法反复几次的常压蒸汽灭菌，以达到杀死微生物营养体和芽孢的目的。操作步骤：100℃，15-30min；37℃恒温过夜；三天。适用于不宜高压灭菌的物质，如糖类明胶牛奶培养基。（二）湿热灭菌法一、加热灭菌法高压蒸汽灭菌适用于一切微生物学实验室、医疗保健机构和发酵工厂中对培养基、发酵罐及附属设备和管道的灭菌及多种器材的灭菌。实验室常用的是0.1MPa，121℃，15～30min。（二）湿热灭菌法一、加热灭菌法湿热灭菌的优点蒸汽来源容易，操作费用低。穿透力强，灭菌效果好。潜热大，冷凝后水分利于湿热灭菌。湿热灭菌的缺点设备费用高。适用范围有限，不能用于怕潮的物料灭菌。二、辐射灭菌法01利用高能量的电磁辐射和微粒辐射来杀死微生物，通常采用紫外线、X射线等进行灭菌。02仅适用于表面灭菌和无菌室、培养间等空间的灭菌，且距照射物不超过1.2m；对固体物料灭菌不彻底，也不能用于液体物料的灭菌。三、过滤除菌法利用过滤方法阻留微生物，适用于血清、抗生素及糖液的除菌。工业上常用过滤法大量制备无菌空气，供好氧微生物培养过程使用。四、化学药品灭菌法某些化学药品与微生物发生反应（蛋白变性、酶失活、细胞通透性）而具有杀菌的作用。1化学药剂适于生产车间环境的灭菌，接种操作前小型器具的灭菌等，不适用于培养基。2化学药品的灭菌使用方法，根据灭菌对象的不同有浸泡、添加、擦拭、喷洒、气态熏蒸等。3四、化学药品灭菌法⑴高锰酸钾⑵漂白粉高锰酸钾溶液的灭菌作用是使蛋白质、氨基酸氧化，使微生物死亡，一般用0.1％～0.25％的溶液，主要用于皮肤消毒。漂白粉的化学名称是次氯酸盐(次氯酸钠，NaOCl)，它是强氧化剂，用于用具和车间环境的灭菌。四、化学药品灭菌法⑶75％酒精溶液使细胞脱水，引起蛋白质凝固变性。对营养细胞、病毒、霉菌孢子均有杀死作用，但对细菌的芽孢杀死作用较差。常用于皮肤和器具表面杀菌。表面活性剂类洁净消毒剂。它在水溶液中以阳离子形式与菌体表面结合，引起菌体外膜损伤和蛋白变性，一般用于器具和生产环境的消毒，不能与合成洗涤剂合用，不能接触铝制品。⑷新洁尔灭四、化学药品灭菌法⑸甲醛⑹过氧乙酸强还原剂，它能与蛋白质的氨基结合，使蛋白质变性，以2份37％甲醛溶液与1份KMnO4混合，或者将37％甲醛溶液直接加热，用于无菌室和车间空间的灭菌，缺点是穿透力差。强氧化剂，它是广谱、高效、速效的化学杀菌剂，对营养细胞、细菌芽孢、真菌孢子和病毒都有杀灭作用。四、化学药品灭菌法⑺戊二醛在酸性条件下，不具有杀死芽孢的能力，只有在碱性条件下，才具有杀死芽孢的能力，常用2％的溶液，常用于器具、仪器和工具等灭菌。毒性较大，易污染环境，且水溶性差，使应用受到限制，而酚类衍生物的使用，扩大了作为消毒剂的使用范围。⑻酚类发酵培养基及设备灭菌项目四发酵工业的无菌操作一、影响培养基灭菌的因素（1）培养基成分油脂、糖类、蛋白质，传热的不良介质，会增加微生物的耐热性，灭菌困难。高浓度盐类、色素，削弱微生物的耐热性，较易灭菌。一、影响培养基灭菌的因素浓度较高培养基，需要较高温度和较长时间灭菌。低浓度的NaCL溶液对微生物有保护作用，随浓度增加保护作用减弱。水中，加热到60-65℃便死亡。10%的糖液中70℃处理4-6min。30%的糖液中70℃需处理30min。例如：大肠杆菌NaCL溶液浓度8%-10%时，则减弱微生物的耐热性。一、影响培养基灭菌的因素（2）培养基的物理状态培养基中固体颗粒小，灭菌容易，颗粒大，则灭菌困难。一般说来，颗粒对培养基灭菌影响不大，但在培养基混有较大颗粒，存在凝结成团的胶体时，影响灭菌。固体培养基比液体培养基的灭菌时间长，例如100℃时液体培养基灭菌时间为1h，而固体培养基需要2-3h。一、影响培养基灭菌的因素（3）pH值（4）泡沫pH值6.0～8.0，微生物最耐热；pH<6.0，氢离子易渗入微生物细胞内，从而改变细胞的生理反应促使其死亡。泡沫中的空气形成隔热层，使传热困难，热难穿透过去杀灭微生物。二、培养基及设备灭菌方式(一）分批灭菌分批灭菌是指将配置好的培养基放在发酵罐中，通入蒸汽加热至灭菌温度，维持一定时间，再冷却到接种温度的灭菌方式，也叫实罐灭菌。分批灭菌是中小型发酵罐常用的一种灭菌方式。二、培养基及设备灭菌方式操作要点1.升温阶段灭菌前，排放夹套及蛇管中的冷水，开启排汽管阀门，夹套内通入蒸汽，发酵温度上升到70℃时，开始由空气过滤器、取样管和放料管通入蒸汽，发酵罐内温度达到120℃时，压力达到0.1MPa,开始保温。二、培养基及设备灭菌方式2.保温阶段凡液面以下各管道都应通蒸汽，液面以上其余各管道则应排蒸汽，不留死角，维持压力，温度恒定直到保温结束。3.降温阶段保温结束，关闭各排汽阀、进汽阀，并通过空气过滤器迅速向罐内通入无菌空气，维持发酵罐降温过程中的正压，且在夹套或蛇管中通入冷却水，使培养基的温度降到所需温度。优点不需要附属设备，操作简便，常用的灭菌方法。二、培养基及设备灭菌方式加热和冷却时间较长，营养随时间降低，罐利用率低；不能采用高温快速灭菌工艺。缺点二、培养基及设备灭菌方式（二）连续灭菌连续灭菌指将配制好的培养基在向发酵罐输送的同时进行加热、保温和冷却而进行灭菌的方法，也连消。分三种形式：连消塔加热的连续灭菌。喷射加热器加热的连续灭菌。薄板换热器加热的连续灭菌。

二、培养基及设备灭菌方式优点营养成分破坏少；发酵罐非生产占用时间短，溶积利用率提高；蒸汽负荷均衡，锅炉利用率高，操作方便；适用于自动化控制，降低劳动强度。缺点不适用于黏度大或固形物含量高的培养基的灭菌；增加了一套连续灭菌设备，增加了操作环节，增加了染菌的概率。二、培养基及设备灭菌方式1.连消塔加热的连续灭菌蒸汽通入培养基中，快速加热至杀菌温度，维持一段时间，后冷却至发酵温度的过程。由连消塔、维持罐和冷却器组成。配料罐将培养基预热60-70℃，防止培养基在杀菌时料液与蒸汽温度相差过大而产生水汽撞击声。二、培养基及设备灭菌方式连消塔使培养基迅速(20s)升温(126-132℃)。维持罐使培养基温度保持在灭菌温度下一段时间。2-7min。冷却管将培养基迅速冷却到40-50℃，输送到灭菌后的发酵罐内。二、培养基及设备灭菌方式4-4-1连消塔加热的连续灭菌流程二、培养基及设备灭菌方式2.喷射加热器加热的连续灭菌由喷射加热、维持罐和真空冷却器组成的连续灭菌系统。蒸汽直接喷入待灭菌的培养液，培养液急剧升温到预定的灭菌温度，培养基在该温度送入维持管维持一段时间后，通过一膨胀阀进入真空冷却器冷却，急速冷却。该流程由于受热时间短，故温度可升到140而不引起培养基的严重破坏。二、培养基及设备灭菌方式A.连续直接蒸汽喷射型二、培养基及设备灭菌方式01保证培养基先进先出，避免过热或者灭菌不彻底。02随着蒸汽的冷凝使培养基稀释。注意二、培养基及设备灭菌方式3.薄板换热器加热的连续灭菌流程该流程采用了薄板换热器作为培养基的加热器和冷却器，蒸汽在薄板换热器的加热段使培养基的温度升高，经维持阶段保持一段时间，然后在薄板换热器的冷却段内冷却，从而使培养基的预热、灭菌及冷却过程可在同一设备内完成。二、培养基及设备灭菌方式该流程虽然加热和冷却所需时间比使用喷射式连续灭菌时间长，但灭菌周期比间歇灭菌小得多；由于