DB22T 2394-2015 猪诱导多潜能干细胞(iPSCs)的制备和鉴定VIP

备案号：48409-2016DB22DB22/T2394—2015猪诱导多潜能干细胞（iPSCs）的制备和鉴定Regulationofpreparationandidentificationofinducedpluripotentstemcellsfrompigs吉林省质量技术监督局发布I1本标准规定了源于猪胎儿成纤维细胞的猪诱导多潜能干细胞（iPSCs）的工作区条件、主GB/T6682分析实验室用水规GB/T24863畜禽细胞体外培养与SN/T2330化妆品胚胎和发育毒性从妊娠25-30天猪胎儿中，去头、尾、四肢、骨骼、内脏后，消化分离获得的有良好增24.1工作区域一般由准备室、缓冲间、无菌室、细胞超净工作台、生物安全柜、冰箱、液氮生物容器、离心机、CO2培养箱、纯水装置、高压蒸汽灭菌所用玻璃器皿和金属器材的清洗与消毒按照GB/各种使用液均用去离子水配制，充分溶解，立即用0.22μm滤膜滤过除菌，除特无菌手术取出妊娠25d～30d的猪子宫，两端扎紧后运回实验室，将子宫整个浸泡于75%的酒消毒30s，将消毒后的子宫送入细胞培养室中，剪开子宫，取出羊膜完整的胎儿置于75%的酒精中浸泡30s，取出用PBS洗3次后移入生物安全柜中。用剪刀将胎儿去除头、尾、四肢、内脏、脊椎骨及肋3箱中消化15min，间隔2min～3min吹打一次。消化结束后加入10ml含10%胎牛血清（FBS）的DMEM终加入10ml含10%FBS的DMEM将细胞重悬，移入2个T-75培养瓶中，每瓶再加入10ml培养液，置于），将包含4种转录因子（Oct4、Sox2、Klf4、c-Myc4，参见附录）和绿色荧光蛋白（GFP)的逆转录病毒质粒（pMX-Oct4、pMX-Klf4、PMX-Sox2、pMX-C-myc和pMX-GFP)及辅助质粒Vsvg分别转入DH5α感受向每管细菌中加入液体LB培养基900μl中培养12h。出现明显菌落后，使用小枪头挑取菌落置于5ml含有氨苄青霉素的液体LB培养基中，37将上述菌液加入到200ml新鲜含氨苄青霉素液体LB培养基中，37℃下200rpm震荡12h，用OMEGA用T-75培养瓶和293细胞培养基，在37.5℃、5%CO2将pMX-Oct4、pMX-Klf4、PMX-Sox2、pMX-C-myc、pMX-GFP和Vsvg质粒各10μg加入1mlOpti-MEM溶液混匀并室温孵育20min。将上述溶液加入293GP细胞中晃匀后，置于培养箱中培养第4天，收集293GT细胞培养液，使用0.45μm滤器过滤，标记好后置于4℃冰箱保存；再向4），ES培养液于37.5℃、5%CO2条件下培养。此后每天换一次培养液，于D在体视显微镜下挑取形态较好，边界清晰的原代iPSCs克隆，使用玻璃针（制作见附录A.18）边缘与饲养层细胞分开，从一端轻轻地将克隆推起，将克隆吸出，轻轻吹打使其分散成若干较小的克用碱性磷酸酶染液对所获细胞克隆进行染色克隆细胞经洗涤、固定、透化、封闭后，向各培养孔中分别加入200μl用1%BSA溶液以1:100的比例稀释的一抗（兔抗-Oct4:ab18976;兔抗-Nanog:ab80892、兔抗-Rex1:ab50828、鼠抗-SSEA-4:ab16287放入培养箱中37℃孵育3h；PBS洗涤3次，将一抗溶液吸尽，PBS洗涤3次，每次5min；每孔中加入2008.7.2.34’,6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）染色将二抗溶液吸尽，避光PBS洗涤3次，每次5min。每孔中加入200μlDAPI染色液（D9542，40mg/mL），5将培养板置于荧光显微镜下观察、拍照分析。猪iPSCs克隆均呈Oct4、Nanog、Rex1阳性，为绿色使用1mg/ml的IV型胶原酶将iPSCs克隆从饲养层上消化下来，将其与饲养层细胞分离，收集到无用BioRTcDNA第一链合成试剂盒获得cDNA；以该cDNA为模板，用目的基因特异性引物（Oct4:F-gtcgccagaagggcaaac,R-cagggtggtgaagtgaggg,125bp;Sox2:F-ccctgcagtacaaR-aagacggcctccaaatcactg,614bp）进行PCR反应，反应条件按试剂盒说明设定。凝胶电泳检查反应产物，获得各基因的相应大小的产物即证明所获猪iPSCs克隆表达上述外源基因（用皮下注射法将2×l06的iPSCs注射到免疫缺陷的裸鼠皮下组织中，3周～4周后手术取畸胎瘤组织，进行常规固定、脱水、浸蜡、石蜡包埋、切片、苏木精-伊红染色或免疫组织化学染色，观察三胚每月应专人定期往液氮生物容器中补充液氮，保持液氮量不6取青霉素0.5g，硫酸链霉素0.5g，溶于100ml水中，分装为1ml/管。临用前从冰箱中取出，每2HPO42.1g，KH2PO40.1g，溶于1000ml水中，调pH7.2处；使用时1ml贮液+7.0mlDMEM+2.0mlNBS，每个Ф35mm培养皿加入蛋白胨10g，酵母粉5g，NaCl10g7碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）+1000将小鼠ES细胞以1:2比例在小鼠胚胎成纤维细胞饲养层上传代培养。以后每48小时收集培养液1次,消化液消化，37.5℃、5%CO2下培养于含DMEM+10%NBS+1%双抗的培养液（M1）中。待细胞70%～80%汇合时，弃旧液，加入1ml丝裂酶素C，继续培养3h～4h；取出培养皿，吸弃丝裂酶素C，用PBS液清洗4～5次，加入适量胰蛋白酶液，室温放置3min～5min，在倒置显微镜下观现明显界限时，加入2ml新鲜M1终止消化；吹打成单细胞悬液，将细胞悬液移入一支10ml离心管中，600r/min离心3min，弃上清；用M1再次洗涤细胞1次～2次，调整细胞密度mm培养皿或24孔培养板中，或制作成饲养层微滴（每滴75～100µl，上覆矿物油），置37℃、5%CO2、从37℃培养了16h～17h的平板培养基上挑取一个单个DH5α菌落，接的试管中，37℃振荡过夜；次日取50µl菌液接种于5m8接产物，冰浴30min，42℃水浴热冲击2min，冰浴5min；加入1ml37青霉素37℃振荡培养1h，4000r/min离心1min，吸弃1mlLB培养基，留下10挑取单菌落接种于30ml含50μg/ml氨苄物接种于500ml含氨苄青霉素的LB中，37℃摇床培养16h～20h；4℃、5000rpm离心10min，收集菌体；将细菌沉淀重悬于10ml冰浴的溶液I（50mmol/L葡萄糖+25mmol/LTrIII（5mol/L乙酸钾60ml+冰醋酸11.5ml+一蒸水28.离心10min，弃上清，敞开瓶口倒置离心瓶，弃尽上清；室温下用70%乙醇洗涤沉淀和管将细胞样品用适量4%多聚甲醛/PBS溶液室温固定15min，（2%巴比妥钠2ml+3%β-甘油磷酸钠2ml+2%无水氯化钙4ml+2%硫酸镁0.2ml+蒸馏水1ml，混匀后调RNA的提取用RNAisoPlus试剂盒进行。弃掉培养皿中的培养液，使用PBS轻轻漂洗2遍，加入1mlRNAisoPlus反复吹打将细胞裂解；将液体转移至1ml无酶的离心管中，室温放置5min；加入200冷的氯仿剧烈震荡15s，室温静置5min；12000g4℃下离心15min，将上清400μl转离心管中，注意不要碰到中间的蛋白层，加入400μl异丙醇上下颠倒混匀；静置10min，12000心管倒置在滤纸上，去尽酒精，室温静置5min左右；等沉淀干燥后，加入20μlDEP9遍，然后每个T25的培养瓶中加入2ml胶原酶IV，在5%CO2、37.