外源基因表达与基因工程药物

第十章外源基因表达与基因工程药物

DNARecombinationTechnologyDNA克隆、测序与重组技术的历史1973年,StanleyCohen等人首次获得体外重组DNA的分子克隆1977年,AllanMaxam和WalterGilbert的化学裂解DNA测序问世不久,Sanger等的双脱氧测序法20世纪90年代启动人类基因组计划(humangenomeproject,HGP)重组DNA技术学(RecombinantDNATechnology)重组DNA技术的发展史1865年G.J.Mendel的豌豆杂交试验。1944年O.T.Avery的肺炎球菌转化实验。1973年美国斯坦福大学的科学家构建第一个重组DNA分子。1977年美国南旧金山由博耶和斯旺森建立世界上第一家遗传工程公司,专门应用重组DNA技术制造医学上重要的药物。1980年开始建造第一家应用重组DNA技术生产胰岛素的工厂。1997年英国罗林研究所成功的克隆了多莉。重组DNA技术重组DNA技术:又称基因工程，是DNA克隆所采用的技术和相关工作的统称。DNA克隆是重组DNA技术的核心，即将某种DNA片段与DNA载体连接成重组DNA，导入细胞进行复制，并随细胞分裂而扩增，最终获得该DNA片段的大量拷贝。一、重组DNA技术相关概念克隆(clone):来自同一始祖的相同副本或拷贝的集合。获取同一拷贝的过程称为克隆化(cloning),即无性繁殖。（一）DNA克隆技术水平:分子克隆(molecularclone)（即DNA克隆）细胞克隆个体克隆（动物或植物）应用酶学的方法,在体外将各种来源的遗传物质（同源的或异源的、原核的或真核的、天然的或人工的DNA）与载体DNA接合成一具有自我复制能力的DNA分子——复制子(replicon),继而通过转化或转染宿主细胞,筛选出含有目的基因的转化子细胞,再进行扩增提取获得大量同一DNA分子,也称基因克隆或重组DNA(recombinantDNA)。DNA克隆过程:生物技术工程:

基因工程、蛋白质工程、酶工程、细胞工程等目的:①分离获得某一感兴趣的基因或DNA②获得感兴趣基因的表达产物（蛋白质）基因工程(geneticengineering)——实现基因克隆所用的方法及相关的工作称基因工程,又称重组DNA工艺学。（二）工具酶

限制性核酸内切酶

DNA聚合酶Ⅰ

逆转录酶

T4DNA连接酶碱性磷酸酶（修饰酶）末端转移酶（修饰酶）

TaqDNA聚合酶重组DNA技术中常用的工具酶工具酶功能限制性核酸内切酶识别特异序列，切割DNADNA连接酶催化DNA中相邻的5´磷酸基和3´羟基末端之间形成磷酸二酯键，使DNA切口封合或使两个DNA分子或片段连接DNA聚合酶Ⅰ合成双链cDNA分子或片段连接缺口平移制作高比活探针DNA序列分析填补3´末端Klenow片段又名DNA聚合酶I大片段，具有完整DNA聚合酶I的5

3

聚合、35

外切活性，而无53

外切活性。常用于cDNA第二链合成，双链DNA3末端标记等反转录酶合成cDNA替代DNA聚合酶I进行填补，标记或DNA序列分析多聚核苷酸激酶催化多聚核苷酸5´羟基末端磷酸化，或标记探针末端转移酶在3´羟基末端进行同质多聚物加尾碱性磷酸酶切除末端磷酸基限制性核酸内切酶(restrictionendonuclease)

限制性核酸内切酶(restrictionendonuclease,RE)是识别DNA的特异序列,并在识别位点或其周围切割双链DNA的一类内切酶。GGATCCCCTAGGGCCTAGGATCCG+BamHⅠ定义:与甲基化酶共同构成细菌的限制修饰系统,限制外源DNA,保护自身DNA。Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ（基因工程技术中常用Ⅱ型）分类:作用:第一个字母取自产生该酶的细菌属名,用大写；第二、第三个字母是该细菌的种名,用小写；第四个字母代表株；用罗马数字表示发现的先后次序。命名:Hin

dⅢ

属

系

株序Haemophilusinfluenzaed株流感嗜血杆菌d株的第三种酶Ⅱ类酶识别序列特点——

回文结构(palindrome)

切口:平端切口、粘端切口GGATCCCCTAGGBamHⅠGTCCAGGCCTAGGATCCG+GGATCCCCTAGGHindⅡGTCGACCAGCTGGACCTG+平端切口粘端切口来源不同的限制酶,但能识别和切割同一位点,这些酶称同功异源酶。GGATCCCCTAGGGCCTAGGATCCG+BamHⅠGGATCCCCTAGGGCCTAGGATCCG+BstⅠ同功异源酶:有些限制性内切酶虽然识别序列不完全相同,但切割DNA后,产生相同的粘性末端,称为同尾酶。这两个相同的粘性末端称为配伍未端(compatibleend)。BamHⅠBglⅡGGATCCCCTAGGAGATCTTCTAGAGCCTAGGATCCG++ATCTAG

GATCTA

同尾酶名称识别序列及切割位点名称识别序列及切割点切割后产生５’突出末端:BamHⅠ5’…G▼GATCC...3’BglⅡ

5’…A▼GATCT...3’EcoRⅠ

5’…G▼AATTC...3’HindⅢ

5’…A▼AGCTT...3’

HpaⅡ

5’…C▼CGG...3’

MboⅠ

5’…▼GATC...3’

NdeⅠ

5’…GA▼TATG...3’切割后产生3’突出末端:ApaⅠ

5’…GGGCC▼C...3’HaeⅡ

5’…PuGCGC▼Py...3’KpnⅠ

5’…GGTAC▼C...3’PstⅠ

5’…CTGCA▼G...3’SphⅠ

5’…GCATG▼C...3’切割后产生平末端:AluⅠ

5’…AG▼CT...3’EcoRⅤ

5’…GAT▼ATC...3’HaeⅢ

5’…GG▼CC...3’PvuⅡ

5’…CAG▼CTG...3’SmaⅠ

5’…CCC▼GGG...3’

限制性内切核酸酶二、DNA连接酶三、DNA聚合酶四、修饰酶1、末端转移酶2、碱性磷酸酶3、T4多核苷酸激酶4.DNA甲基化酶目的基因(targetgene)

cDNA(complementaryDNA)

指经反转录合成的、与RNA(通常指mRNA或病毒RNA)互补的单链DNA。以单链cDNA为模板、经聚合反应可合成双链cDNA。

基因组DNA(genomicDNA)

指代表一个细胞或生物体整套遗传信息(染色体及线粒体)的所有DNA序列。

基因载体定义为携带目的基因,实现其无性繁殖或表达有意义的蛋白质所采用的一些DNA分子。

常用载体质粒DNA噬菌体DNA病毒DNA克隆载体(cloningvector)为使插入的外源DNA序列被扩增而特意设计的载体称为克隆载体。表达载体(expressionvector)为使插入的外源DNA序列可转录翻译成多肽链而特意设计的载体称为表达载体。载体的选择标准能自主复制；具有两个以上的遗传标记物,便于重组体的筛选和鉴定；有克隆位点（外源DNA插入点）,常具有多个单一酶切位点,称为多克隆位点(MCS)；分子量小,以容纳较大的外源DNA。可接合质粒如F因子(Ffactor)细菌染色体外的小型环状双链DNA分子。质粒定义质粒

(plasmid)特点:

能在宿主细胞内独立自主复制；带有某些遗传信息,会赋予宿主细胞一些遗传性状。质粒载体分类1、严紧型质粒其复制于宿主染色体同步，拷贝数较低，一个细胞内仅仅有1～3个。2.松弛型质粒：其复制与宿主染色体不同步，可以单独复制，拷贝数较高，一个细胞内可以有10～500个pBR322载体特点特点：1、分子量小2、有两个抗性基因3.是松弛型质粒应用：1、常规原核克隆载体2、构建原核表达载体3.构建其他载体pUC系列载体特点特点：1、分子量更小，拷贝数更高，不用氯霉素处理即可在每个细胞内扩增500～700个拷贝。2.针对所含的lacZ’可以α互补和蓝白筛选法筛选转化子。λ噬菌体DNA改造系统λgt系列（插入型,适用cDNA克隆）EMBL系列（置换型,适用基因组克隆）噬菌体(phage)

M13噬菌体DNA改造系统（含lacZ基因）

M13mp系列

pUC系列粘性质粒(cosmid)粘性质粒也称柯斯载体。是带有粘性末端位点的质粒,柯斯质粒是人工建造的的含有λDNA的cos序列和质粒复制子的特殊类型的质粒载体。

粘性质粒用于克隆大片段DNA的载体,它是由λ噬菌体的cos末端及质粒重组而成的载体。cosmid载体带有质的复制起点、克隆位点、选择性标记以及λ噬菌体用于包装的cos末端等。

粘性质粒该载体在体外重组后,可利用噬菌体外包装的特性进行体外包装,利用噬菌体感染的方式将重组DNA导入受体细胞。但它不会产生子代噬菌体,而是以质粒DNA的形式存在于细胞内。酵母人工染色体(yeastartificialchromosome,YAC)细菌人工染色体(bacterialartificialchromosome,BAC)动物病毒DNA改造的载体（如腺病毒,腺病毒相关病毒,逆转录病毒）其他重组DNA技术基本原理基本原理目的基因的获取DNA导入受体细胞外源基因与载体的连接克隆载体的选择和构建重组体的筛选克隆基因的表达

以质粒为载体的DNA

克隆过程（一）目的基因的获取基因组DNA文库(genomicDNAlibrary)从组织细胞提取2.cDNA文库(cDNAlibrary)逆转录合成3.聚合酶链反应(PCR)4.化学合成法已知目的基因的核苷酸序列或其产物的氨基酸序列。化学合成法获取目的基因由已知氨基酸序列推测可能的DNA序列。组织或细胞染色体DNA基因片断克隆载体重组DNA分子含重组分子的转化菌限制性内切酶受体菌基因组DNA文库存在于转化细胞内由克隆载体所携带的所有基因组DNA的集合从基因组DNA文库获取目的基因限制酶切位点限制酶消化除去中间片段cosLRcoscosL左臂Rcos右臂真核生物染色体DNA限制酶部分消化外源DNA与载体DNA混合连接反应体外包装用重组噬菌体感染大肠杆菌~20KbDNA片段cosLRcos~20Kb外源DNA片段基因文库用随机切割的真核生物染色体DNA片段构建基因文库

mRNAcDNA

双链cDNA重组DNA分子cDNA文库

反转录酶载体受体菌复制

从cDNA文库获取目的基因逆转录酶AAAA

TTTTAAAASI核酸酶

DNA聚合酶Ⅰ碱水解

TTTT（二）克隆载体的选择和构建目的不同,操作基因的性质不同,载体的选择和改建方法也不同。（三）外源基因与载体的连接方式:(1)同一限制酶切位点连接(2)不同限制酶切位点连接配伍末端连接非配伍末端连接粘性末端连接BamHⅠ切割反应

GGATCCCCTAGGT4

DNA连接酶15ºCGATCCGGCCTAG+目的基因用BamHⅠ切割载体DNA用BamHⅠ切割重组体载体自连目的基因自连同一限制酶切位点连接不同限制酶切位点（非配伍末端）的连接EcoRⅠ切割位点Bg

lⅡ切割位点+EcoRⅠ+Bg

lⅡ双酶切EcoRⅠ+Bg

lⅡ双酶切T4

DNA连接酶15ºC重组体配伍末端的连接情况和同一限制酶切位点连接相似。平端连接

限制性内切酶切割产生的平端粘端补齐或切平形成的平端适用于:目的基因载体限制性内切酶限制性内切酶T4DNA连接酶15ºC重组体载体自连目的基因自连在末端转移酶(terminaltransferase)的作用下,在DNA片段末端加上同聚物序列、制造出粘性末端,再进行粘端连接。同聚物加尾连接5´3´3´5´载体DNA5´3´3´5´目的基因限制酶或机械剪切限制酶5´3´3´5´5´3´T(T)nT

T(T)nT3´5´5´

3´3´5´3´A(A)nA

A(A)nA3´5´λ-核酸外切酶λ-核酸外切酶末端转移酶+dATP末端转移酶+dTTPT(T)nTA(A)nAA(A)nAT(T)nTT4

DNA连接酶15ºC重组体5´由平端加上新的酶切位点,再用限制酶切除产生粘性末端,而进行粘端连接。人工接头(linker)连接人工接头及其应用CCGAATTCGGGCTTAAGC5´-3´-EcoRⅠEcoRⅠEcoRⅠEcoRⅠ受体菌条件:安全宿主菌限制酶和重组酶缺陷处于感受态(competent)导入方式:转化(transformation)转染(transfection)感染(infection)（四）重组DNA导入受体菌转化作用通过自动获取或人为地供给外源DNA,使细胞或培养的受体细胞获得新的遗传表型,称为转化作用(transformation)。例:溶菌时，裂解的DNA片段被另一细菌摄取。转导作用当病毒从被感染的（供体）细胞释放出来、再次感染另一（供体）细胞时,发生在供体细胞与受体细胞之间的DNA转移及基因重组即为转导作用(transduction)。常用转化方法1、氯化钙法2、噬菌体感染法3、完整细胞转化法4、原生质体转化法5.电穿孔法1.直接选择法(1)抗药性标记选择(2)标志补救(markerrescue)(3)分子杂交法原位杂交Southern印迹2.免疫学方法如免疫化学方法及酶免检测分析等（五）细胞筛选和DNA鉴定(插入失活法)

抗药性标记选择α互补利用α互补原理筛选重组体pUC18

原位杂交

Southern印迹鸡的β肌球蛋白的克隆和检出免疫学方法

重组DNA技术操作过程可形象归纳为:小结分分离目的基因切限制酶切目的基因与载体接拼接重组体

转转入受体细胞筛筛选重组体

重组DNA技术操作的主要步骤载体质粒噬菌体病毒目的基因（外源基因）基因组DNA

cDNA人工合成PCR产物限制酶消化开环载体DNA目的基因连接酶重组体转化体外包装，转染带重组体的宿主筛选表型筛选酶切电泳鉴定菌落原位杂交第四节目的基因表达表达体系的建立:表达载体的构建受体细胞的建立表达产物的分离纯化克隆基因的表达标准：选择标志 强启动子翻译调控序列 多接头克隆位点E.coli表达体系的不足：1、不宜表达真核基因组DNA；2、不能加工表达的真核蛋白质；3、表达的蛋白质常形成不溶性包涵体4.很难表达大量可溶性蛋白。1.原核表达体系(E.coli表达体系最为常用)大鼠胰岛素原cDNA的表达和分泌

优点:可表达克隆的cDNA及真核基因组DNA可适当修饰表达的蛋白质表达产物分区域积累缺点:操作技术难、费时、经济

转染

——将表达载体导入真核细胞的过程方法:磷酸钙转染DEAE葡聚糖介导转染电穿孔脂质体转染显微注射2.真核表达体系（酵母、昆虫、哺乳类动物细胞）表达载体pFASTBACI的物理图谱表达载体YEpIPT的物理图谱第五节

DNA重组技术在医学中的应用DNARecombinationTechniqueisCloslyRelatedwithMedicine一、重组DNA技术的应用（一）基因文库构建1、基因组文库构建2.cDNA文库构建（二）定点诱变1、定点诱变技术2.PCR定点诱变二、疾病基因的发现与克隆根据基因定位克隆之并研究其性质,而认识疾病的分子机制。

疾病基因发现的两个典型例子:

脆性X综合征:

脆性X染色体是指在Xq27～Xq28带之间的染色体呈细丝样,导致其相连的末端呈随体样结构,由于这一细丝样部位易发生断裂,故称脆性部位（fragilesite）。Kallmann综合征:卡尔曼式综合征是一种遗传性疾病,有关的基因为KALIG-1,位于X染色体短臂,表现为性腺发育不全伴嗅觉丧失或减退,本病呈家族性或