《缺血性脑卒中动物模型评价技术规范 第1部分：啮齿类动物》（编制说明）

《缺血性脑卒中动物模型评价技术规范第1部分：啮齿类动物》编制说明一、工作简况（一）任务来源缺血性脑卒中(cerebralischemicstroke,CIS)，指脑血循环障碍病因导致脑血管堵塞或严重狭窄，使脑血流灌注下降，进而缺血、缺氧导致脑血管供血区脑组织死亡。流行病学调查显示，CIS是我国排名第二的致死性疾病，年发病率约为247/10万人，死亡率约为115/10万人，未来随着人口结构的老龄化，我国CIS的发病率将持续升高，高致死和致残率将给社会和家庭造成严重负担，因此，近年来CIS已经成为重大慢性非传染性疾病研究的热点方向之一。利用啮齿类构建的缺血性脑卒中模型是国内外广泛应用于CIS发病机制研究和药物评价的动物模型。基于广东省实验动物监测所参与国家重点领域研发“十三五”项目（急性局灶性脑缺血后全脑保护评估体系及转化研究）和主持的国家自然科学基金青年基金“PFKFB3基因调控胶质细胞糖酵解途径参与缺血性脑卒中发生的作用机制研究”，我们在开展缺血性脑卒中啮齿类模型制备技术研究基础上，结合啮齿类具有模型制备适用性和可控依据经典的啮齿类CIS模型方法，对缺血性脑卒中啮齿类模型制备技术进行规范，制定本标准。（二）协作单位广东省实验动物监测所、中山大学附属第一医院、南方医科大学南方医院、深圳市药品检验研究院（深圳市医疗器械检测中（三）主要工作过程1.起草阶段并结合具体临床应用的实际需求为主要参考依据，提出编制团体标准《缺血性脑卒中动物模型评价技术规范》的计划。本标准由广东省精准医学应用学会组织，广东省实验动物监测所牵头制定，其它单位共同参与起草，于2022年11月提交团体标准《缺血性脑卒中动物模型评价技术规范》的立项申请书，经学会秘书长审批通过后，于11月1日正式发布立项公告，并于同日在全国团体标准平台发布立项公示。立项公示后，起草工作组着手开展标准的编制工作并组织多次起草工作组的会议讨论。经过多轮研讨和修改，2023年6月在广东省精准医学应用学会主办的第三届华南疾病模型与临床研究论坛之疾病模型标准撰写与宣讲研讨会上，本标准起草工作组就标准初稿内容进行了汇报，并同与会专家进行了充分交流。经研究，起草工作组形成共识并提出以下建议：在同一标准项目下，将标准分为《缺血性脑卒中动物模型评价技术规范第1部份：啮齿类动物》和《缺血性脑卒中动物模型评价技术规范第2部份：非人灵长类动物》两个部分来进行编制，2023年9月，《缺血性脑卒中动物模型制备技术规范第1部分：啮齿类动物》独立开展了有关立项审查和发布工作。标准起草工作组于2024年9月完成了编写，上报学会标委会秘书处，于10月完成了对本标准内容的审核和格式重排，并启动发布征求意见公示工作。2.征求意见阶段2024年11月学会标委会秘书处将标准编制说明和征求意见稿通过全国团体标准平台发布公示，面向相关行业的单位和个人征求意见。到2024年12月，共收集到？条征求意见，经标准起草工作组讨论，采纳？条，不采纳？条。3.审查及报批阶段标准起草工作组将对收集到的意见进行认真分析和处理，对征求意见稿进行最后修改，形成标准送审稿。由学会标委会秘书处组织技术审查。标准起草工作组根据审查意见修改整理后，最终形成标准草案报批稿，报广东省精准医学学会报批。（四）起草组成员及其工作主要起草成员皆参与了本标准的研究、讨论和不同章节的编二、标准编制原则和确定标准主要内容（一）标准编制原则标准制定遵守国家和地方相关法律、法规、方针、政策，在广东省精准医学学会章程规定的业务范围内，符合精准医学相关技术标准制定范围，是学会疾病动物模型分会发展规划内容。2.公正性原则标准制定遵循开放、透明、公平、公正的原则，本着动物模型制备需要满足相似性、重复性、可依性、适用性和可控性、易行性和经济性的原则，吸纳医疗机构、检测机构、实验动物研究机构代表参团体标准制定。3.先进性原则按照有利于科学合理利用资源，有利于提高经济效益、社会效益、生态效益的原则，做到技术上先进、经济上合理，有利于精准医学行业发展。4.正确性原则标准编写依据国家重点领域研发结果，编写过程中，对技术方法、评价参数等内容进行核验，保证其正确性。通过使用精准的描写词汇、紧凑严密的语句结构来准确表达目的，力求让不同知识水平不同专业背景的人充分理解标准所述内容。5.简明性原则标准编写时注意标准内容简洁明了，力求让标准内容通俗易懂，并通过使用大众化语言使使用者在参照本标准时能够正确理解和执行。6.本标准规定了啮齿类（实验小鼠和大鼠）缺血性脑卒中模本标准适用于实验啮齿类局部永久性和缺血再灌注脑卒中模型构建及应用评价。（二）标准主要内容本标准由范围、规范性引用文件、术语和定义、动物质量和饲养要求、动物模型制备方法、评价方法和结果判定共7部分组成。主要技术内容如下。本标准规定了实验小鼠、大鼠缺血性脑卒中模型制备的动物质量、饲养要求、制备方法、评价方法和结果判定。本标准适用于啮齿类动物缺血性脑卒中模型构建及应用评价。2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB14922实验动物微生物、寄生虫学等级及监测GB/T14924.2实验动物配合饲料卫生标准GB14924.3实验动物配合饲料营养成分GB14925实验动物环境及设施3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1缺血性脑卒中cerebralischemicstroke是指各种原因导致的脑组织血液供应障碍，并由此产生的缺血缺氧性坏死，进而出现神经功能障碍的一类临床综合征。3.2神经功能评价量表neurologicalfunctionassessmentscale用于评估动物模型神经功能缺损程度和恢复情况的工具，评价内容包括意识水平、感觉系统、运动系统和骨骼肌协调等。3.3动物行为评价annimalbehavioralassessment以实验动物为对象，在自然界或实验室内，以观察和实验方式对动物的行为信息进行采集、分析和处理，评价动物行为信息的生理和病理意义。3.4运动能力评价motorfunctionassessment利用不同动物运动评价设备，如步态分析系统等，观察动物在不同情境下的运动行为变化，用于测试和评价动物的运动能4动物质量及饲养要求动物质量应符合GB14922的要求。饲养环境应符合GB14925的要求。饲料应符合GB/T14924.2和GB14924.3的要求。5模型制备方法实验啮齿类动物缺血性脑卒中模型制备方法包括栓塞法、光化学法和电凝法等。5.1栓塞法实验小鼠/大鼠缺血性卒中模型构建的经典方法，通过颈外动脉插入线栓或血栓等，导致大脑中动脉阻塞和再灌注。具体操作如下：1)术前准备。选择小鼠（体重控制在25-30g）、大鼠（体重控制在250至300g术前动物禁食12小醉、备皮、消毒等准备工作。2)麻醉。通常采用吸入类麻醉剂进行麻醉，手术过程中保温。3)手术。从颈部正中切开皮肤，利用镊子钝性分离颈部腺体组织、筋膜，暴露并分离颈总动脉（CCA）、颈外动脉（ECA）和颈ECA远心端和近心端（留长线头并从两个结扎点中间剪断ECA。然后在ECA近分叉处用眼科剪45°剪一小斜口并插入线栓，松开ICA动脉夹，缓慢向ICA推入线栓，当线栓遇到轻微阻力时即可停止，线栓插入深度一般根据小鼠和大鼠体重和实验需求进行调整，小鼠常见深度为9-10mm（25-30g大鼠常见深度为18-22mm（250-300g）。插入过程中避免用力过猛后松开CCA结扎，缝合皮肤。阻断血流造成脑局部缺血60分钟后，拔出线栓实现再灌注。术后，注意保持伤口清洁干燥，防止注意观察小鼠的生命体征变化，如呼吸、心率等。5.2光化学法实验小鼠/大鼠皮层缺血性脑卒中模型构建的常用方法，实验操作技术简单。利用光敏剂（如玫瑰红）在特定强度光照下发生光化学反应，在大脑的照射局部产生脑水肿和血小板微血栓，形成局灶性脑梗死。具体操作如下：1)术前准备。术前动物禁食12小时，自由饮备皮、消毒等准备工作。2)麻醉。通常采用注射类麻醉剂进行麻醉，手术过程中保温。3)手术。将小鼠/大鼠头部固定于脑立体定位仪上，在前囟旁划定圆形区域，该区域以外进行避光处理。从动物眼底注射玫瑰红溶液，开启激光发射器（532nm对圆形区域进行激光照射8分钟，形成局部永久缺血，缝合头皮。实验小鼠和大鼠缺血性脑卒中永久闭塞模型构建方法。利用开颅手术暴露啮齿类动物脑中动脉并进行永久性阻断。具体方法1)术前准备。术前动物禁食12小时，自由饮备皮、消毒等准备工作。2)麻醉。通常采用吸入类麻醉剂进行麻醉，手术过程中保温。3)手术。在无菌条件下进行手术操作，切开小鼠/大鼠头部皮肤，暴露颅骨。使用微型电凝器，将电凝探头置于小鼠/大鼠大脑中动脉的适当位置，使大脑中动脉永久性阻断。注意控制电凝时间和强度，避免损伤周围组织。注意观察小鼠的生命体征变化，如呼吸、心率等。6评价方法6.1脑血流检测采用激光散斑血流仪检测动物脑缺血情况。动物麻醉后俯卧，头部备皮消毒后，切开皮肤，暴露颅骨，在激光散斑成像仪下，观察脑血流图像，选定损伤侧缺血区域，测定10s内平均血流值，同时，选定非损伤侧相同区域测定血流值，评价大脑中动脉阻断后的缺血情况。6.2神经损害严重程度评分造模前先按照附录A对动物进行神经功能评分，排除不满足评分要求的动物。造模后2小时，动物完全清醒后，在安静环境中，进行神经神经损害严重程度评价。逐项评分，所有单项分数相加则为动物神经损害程度评分，总分为18分。一般选择3名观察人员进行量表评价，统计3名观察员的平均值作为神经功能评分量值。6.3运动行为评价采用疲劳转棒装置进行运动行为评价。转速设置从0rpm缓慢加速至40rpm，测试时间为300秒，测试时将动物置于旋转棒上，记录动物从旋转棒上掉落的时间。造模前，按照上述参数设置对动物进行适应性训练，待动物从旋转棒上掉落的时间稳定按照上述参数设置开展疲劳转棒试验，记录动物从转棒上掉落的时间，每天进行3次试验，每次间隔30分钟。根据3次测定的平均掉落时间评价动物运动能力。6.4脑梗死体积测定采用2,3,5-三苯基氯化四氮唑（TTC）染色评价动物脑梗死体积。动物安乐死后取脑，并在脑模具中将脑切成厚度相同的切片，随后将切片置于TTC染液中，避光37℃烘箱孵育。待正常脑组织呈现出鲜红色，脑梗部位呈现出苍白色后，将脑片置于4%多聚甲醛中固定后拍照，并将图像导入医学图像处理软件ImageJ分别计算每张脑切片的面积，所有切片梗死灶所在半脑正常脑组织面积、对侧正常半脑面积相加后乘以切片厚度，得到梗死灶所在半脑正常脑组织体积及对侧正常半脑体积，并利用公式计算脑梗死体积比。6.5组织病理诊断动物麻醉后放血，分别用生理盐水和多聚甲醛对脑组织进行灌注，分离脑组织，经4%多聚甲醛固定，梯度酒精脱水，二甲苯透明后进行石蜡包埋制成蜡块，在组织切片机上将蜡块切成厚度为4μm的切片，切片应包含整个梗死灶及周边半暗带组织，然后进行苏木素-伊红或尼氏染色并封片。由实验动物病理学专家进行双盲阅片诊断，观察梗死灶和半暗带组织神经元坏死及炎症细胞活化情况。7.1模型活体评价指标1)脑血流。造模后，可见动物脑缺血区域血管内血流信号明显减弱，表明动物出现脑局部缺血。2)神经损害严重程度评分。神经损害严重程度评分越高说明损分为严重损伤。造模后，模型组动物神经评分应至少达到轻度损伤或以上。3)运动功能。造模后，模型组动物从旋转棒上掉落时间平均值应显著低于造模前。4)磁共振成像。必要时，造模小鼠通过磁共振扫描显示典型的梗死特征。7.2脑梗死体积动物处死后，TTC染色显示脑梗死部位明显的苍白色。可通过下列公式计算动物脑梗死体积百分比，脑梗死体积比（%）=（对侧正常半脑体积-梗死灶所在半脑正常脑组织体积）×100%÷对侧正常半脑体积。7.3组织病理动物处死后，病理诊断可见梗死灶内大量神经细胞坏死，神经元核固缩、胞浆呈嗜酸性，在半暗带区可见星形胶质细胞和小胶质细胞过度活化，胶质细胞胞体增大和大量聚集以及炎症细胞三、主要试验（或验证）的分析、综述报告，技术经济论证，预期的经济效果标准编制相关单位，在国家重点研发计划“急性局灶性脑缺血后全脑保护评估体系及转化研究”期间，团队完成从啮齿类到非人灵长类的脑缺血性卒中模型构建，建立影像学、行为学的评价体系。项目的结题报告、相关的成果可体现的标准模型的可行性。并进一步经过文献查阅、技术调研、咨询、验证、收集和总结相关资料，对评价试验方案进行了进一步的优化，具有较强的适用性、可行性。1.脑血流检测。激光散斑血流检测是评价啮齿类脑缺血性卒中模型血管阻塞的重要手段(Yuetal.2010)，Pubmed检索显示该方法在372篇已发表的相关啮齿类缺血性脑卒中模型论文中被应用。我们使用光化学法构建的小鼠缺血性脑卒中模型，对造模后24小时脑血流情况进行测定，脑缺血区域的相对血流值（CBF）较对照组图1小鼠缺血性脑卒中模型脑血流值测定2.神经功能评分。依据常用的啮齿类神经功能评价量表开展评价(Chenetal.2001,Hattorietal.2012)，Pubmed检索显示该方法在490篇已发表的相关啮齿类缺血性脑卒中模型论文中被应用。我们使用线栓法构建的小鼠脑缺血性卒中模型，造模后24小时神经功能进行评价，与对照组进行比较，模型组小鼠较对照组评分显著升高，模型组评分为10.60±0.8718分，动物表现为中度神经功能图2小鼠缺血性脑卒中模型神经功能评分3.运动功能评价。疲劳转棒测试是评价啮齿类缺血性脑卒中模型运动功能损伤的常用方法(Bernard,BalkayaandRex2016)，Pubmed检索显示该方法在195篇已发表的相关啮齿类缺血性脑卒中模型论文中被应用。我们使用光化学法构建的小鼠缺血性脑卒中模型进行运动功能评价，造模24小时后，模型组小鼠在转棒上停留时间较图3小鼠缺血性脑卒中模型运动功能评价4.脑梗死体积测定。2,3,5-三苯基氯化四氮唑（TTC）染色是观察啮齿类动物脑缺血脑梗死体积的常用技术(Liuetal.2009)，Pubmed检索显示该方法在369篇已发表的相关啮齿类缺血性脑卒中模型论文中被应用。我们使用线栓法和光化学法构建的小鼠缺血性脑卒中模型进行脑梗死体积测定，造模后24小时，TTC染色显示，造模后两种模型脑中均出现明显的梗死灶（图4，白色箭头所示）。图4小鼠缺血性脑卒中模型脑梗死体积测定5.组织病理诊断。组织病理诊断是评价啮齿类脑缺血模型组织细胞变化的经典方法(Sommer2016)。我们使用线栓法和光化学法构建的小鼠缺血性脑卒中模型，HE染色显示，光化学法造模后7天，脑组织显示明显的脑梗死灶，梗死灶内可见大量神经细胞坏死，神经元核固缩、胞浆嗜酸性等（图5）。免疫荧光染色显示，梗死灶内神经元特异性染色明显减少（图6，NeuN梗死灶周边出现大量聚集，胶质细胞胞体增大等病理改变。图5小鼠缺血性脑卒中模型HE染色图6小鼠缺血性脑卒中模型免疫荧光染色。GFAP，星形胶质细胞；Iba-1，小胶质细胞；NeuN，神经元。四、标准涉及的相关知识产权说明1.没有违反相关法律法规及强制性标准，目前暂无相关的国家标准、行业标准。2.参考的实验动物的饲养管理相关标准，与制定的团体标准不冲突。GB14922实验动物微生物、寄生虫学等级及检测GB/T14924.2实验动物配合饲料卫生标准GB14924.3实验动物配合饲料营养成分GB14925实验动物环境及设施T/CALAS104实验动物实验猴神经行为评价规范3.2023年2月中国实验动物学会发布了《实验动物缺血性脑卒中啮齿类动物模型评价规范》团体标准，本标准与该标准内容主要差别为，本标准除对模型评价技术进行规范外，还对常用的啮齿类缺血性脑卒中模型制备技术进行了规范，同时，在模型评价方面，本标准在运动行为等指标上与该标准也存在差异。五、采用国际标准的程度与水平的简要说明目前，缺血性脑卒中造模和模型评价方法主要由国外实验室建立，我国在这方面的研究起步较晚，主要沿用国外文献报道的评价方法。我们在前期研究中，建立缺血性脑卒中临床前多中心评价体系（广东省实验动物监测所，中山大学附属第一医院，广西医科大学附属第一医院，中国科学院深圳先进技术研究院通过构建啮齿类动物模型，并通过神经功能，梗死体积，学习记忆运动功能等方面进行评价，建立了多中心评价标准，并在多个团队进行测试，证明该方案渐变可行，完全满足评价要求，具有推广应用价值，有效支撑标准制定。六、重大意见分歧的处理经过和依据七、其他应予说明的事项参考文献Bernard,R.,M.Balkaya&A.Rex.2016.BehavioralTestinginRodentModelsofStroke,PartI.InRodentModelsofStroke,ed.U.Dirnagl,199-223.NewYork,NY:SpringerNewYork.Chen,J.,Y.Li,L.Wang,Z.Zhang,D.Lu,M.Lu&M.Chopp(2001)Therapeuticbenefitofintravenousadministrationofbonemarrowstromalcellsaftercerebralischemiainrats.Stroke,32,1005-11.Han,J.,S.Yang,X.Hao,B.Zhang,H.Zhang,C.Xin&Y.Hao(2020)ExtracellularVesicle-DerivedmicroRNA-410FromMesenchymalStemCellsProtectsAgainstNeonatalHypoxia-IschemiaBrainDamageThr