第8章-分光光度法

第八章吸光光度法1化学分析：常量组分(>1%),Er

0.1%～0.2%

依据化学反应,使用玻璃,测定绝对值。

化学分析与仪器分析方法比较仪器分析：微量组分(<1%),Er

1%～5%

依据物理或物理化学性质,需要特殊的仪器

测定相对值。准确度高灵敏度高28.1吸光光度法的基本原理特点:灵敏度高：测定下限可达10-5～10-6mol/L,10-4%～10-5%准确度能够满足微量组分的测定要求：相对误差2～5％（精密光度计为1～2％）操作简便快速应用广泛

吸光（分光）光度法是基于被测物质分子对光具有选择性吸收的特性而建立起来的分析方法。3研究物质在紫外(200-400nm)、可见光区(400-800nm)

的分子吸收光谱

的分析方法称为紫外-可见分光光度法。

这种分子吸收光谱产生于价电子和分子轨道上的电子在电子能级间的跃迁，广泛用于无机和有机物质的定性和定量测定。4光学光谱区远紫外近紫外可见近红外中红外远红外（真空紫外）10nm~200nm200nm

~380nm380nm

~780nm780nm~2.5

m2.5

m

~50

m50

m

~300

m5溶液中溶质分子对光的吸收与吸收光谱

/nm颜色互补光400-450紫黄绿450-480蓝黄480-490绿蓝橙490-500蓝绿红500-560绿红紫560-580黄绿紫580-610黄蓝610-650橙绿蓝650-760红蓝绿不同颜色的可见光波长及其互补光6300400500600700

/nm350525545Cr2O72-MnO4-1.00.80.60.40.2AbsorbanceCr2O72-、MnO4-的特征吸收曲线（吸收曲线,A~

）3507苯和甲苯在环己烷中的特征吸收曲线苯(254nm)甲苯(262nm)A

23025027084.光吸收基本定律:Lambert-Beer定律A=lg(I0/It)=kbcItI0bdxII-dIs朗伯定律(1760年)A=lg(I0/It)=k1b比尔定律(1852年)A=lg(I0/It)=k2c吸光度介质厚度(cm)9吸光度与光程的关系A=

bc

光源检测器0.00吸光度检测器b样品光源0.22吸光度光源检测器0.44吸光度b样品b样品10吸光度与浓度的关系

A=

bc

b2>b1

吸光度0.00光源检测器

吸光度0.22光源检测器b1

吸光度0.42光源检测器b211吸光度的加和性与吸光度的测量A=A1+A2+…+An

用参比溶液调T=100%（A=0），再测样品溶液的吸光度，即消除了吸收池对光的吸收、反射，溶剂、试剂对光的吸收等。12T－透光率（透射比）（Transmittance）A

=lg(I0/It)=lg(1/T)=-lgT

=kbcA

：Absorbency，Absorbence，吸光度13吸光度A、透射比T与浓度c的关系ATcA=kbc14朗伯-比尔定律的适用条件单色光

应选用

max处或肩峰处测定2.吸光质点形式不变

离解、络合、缔合会破坏线性关系应控制条件(酸度、浓度、介质等)3.稀溶液

浓度增大，分子之间作用增强15

01234mg/mlA。。。。*0.80.60.40.20溶液浓度的测定A＝abc工作曲线法(标准曲线)朗伯-比尔定律的分析应用16偏离Beer定律的因素依据Beer定律，A与C关系应为经过原点的直线偏离Beer定律的主要因素表现为以下两个方面（一）光学因素（二）化学因素

正偏离，结果偏低负偏离，结果偏高17（一）光学因素

1．非单色光的影响：

Beer定律应用的重要前提——入射光为单色光，

max

照射物质的光经单色器分光后并非真正单色光其波长宽度由入射狭缝的宽度和棱镜或光栅的分辨率决定为了保证透过光对检测器的响应，必须保证一定的狭缝宽度这就使分离出来的光具一定的谱带宽度18续前2．杂散光的影响：

杂散光是指从单色器分出的光不在入射光谱带宽度范围内，与所选波长相距较远杂散光来源：仪器本身缺陷；光学元件污染造成杂散光可使吸收光谱变形，吸光度变值3．反射光和散色光的影响：反射光和散色光均是入射光谱带宽度内的光直接对T产生影响散射和反射使T↓，A↑，吸收光谱变形注：一般可用空白对比校正消除4．非平行光的影响：使光程↑，A↑，吸收光谱变形19（二）化学因素Beer定律适用的另一个前提：稀溶液浓度过高会使C与A关系偏离定律208.2比色法和分光光度法

8.2.1比色法方便、灵敏，准确度差。常用于限界分析。观察方向1.目视比色法c4c3c2c1c1c2c3c4212.光电比色法通过滤光片得一窄范围的所谓单色光(几十nm)光电比色计结构示意图灵敏度和准确度较差228.2.2分光光度法通过棱镜或光栅得到一束近似的单色光.波长可调,故选择性好,准确度高.紫外-可见分光光度计的基本结构是由五个部分组成：即光源、单色器、吸收池、检测器和信号显示系统。

光源 单色器吸收池检测器显示系统23分光光度计的主要部件1、光源：发出所需波长范围内的连续光谱，有足够的光强度,而且稳定。 可见光区：钨灯，碘钨灯(320～2500nm)

紫外区：氢灯，氘灯(180～375nm)2、单色器：将光源发出的连续光谱分解为单色光的装置。

棱镜:玻璃350～3200nm,石英185～4000nm

光栅:波长范围宽,色散均匀,分辨性能好,使用方便“热光源”“气体放电灯”243、吸收池：(比色皿)用于盛待测及参比溶液。 可见光区：光学玻璃池 紫外区：石英池4、检测器：利用光电效应，将光能转换成电流讯号。 光电池，光电管，光电倍增管5、显示系统： 低档仪器：刻度显示

中高档仪器：数字显示，自动扫描记录25棱镜：依据不同波长光通过棱镜时折射率不同单色器入射狭缝准直透镜棱镜聚焦透镜出射狭缝白光红紫λ1λ280060050040026光栅：在镀铝的玻璃表面刻有数量很大的等宽度等间距条痕(600、1200、2400条/mm)。M1M2出射狭缝光屏透镜平面透射光栅光栅衍射示意图原理：利用光通过光栅时发生衍射和干涉现象而分光.27检测器SeAu，Ag半导体h

硒光电池Ag、Au28光电管红敏管625-1000nm蓝敏管200-625nmNi环（片）碱金属光敏阴极h

29光电倍增管待扫描160-700nm1个光电子可产生106～107个电子30分光光度计的类型311、单光束分光光度计：分光后的单色光直接透过吸收池，轮流测定蚕比溶液和样品溶液。普遍使用的有：721型：单色器为棱镜，适用波长350-800nm，由微安表读数；722型：单色器为光栅，适用波长330-800nm，数字显示读数；751型：单色器为石英棱镜，适用波长200-1000nm，电位补偿式读数；752型：单色器为光栅，适用波长200-1000nm，数字显示读数；322、双光束分光光度计：从光源发出的光经分光后由扇形旋转镜分成两束，交替通过参比液和样品液，然后经反射镜交替投射到检测器上。检测器在瞬间接受处理参比信号和样品信号，将其信号差转换为吸光度。双光束仪器克服了单光束仪器由于光源不稳所引起的误差。3、双波长分光光度计：从光源发出的光经过两个单色器后，得到不同的两束单色光，交替照射同一溶液，由测量系统显示出两个波长下的吸光度的差值，其差值与待测组分的浓度成正比。双波长分光光度计的特点是降低杂散光，能测定一般光度计不宜测定的浑浊溶液。338.3显色反应及其影响因素8.3.1显色剂与显色反应无机显色剂:SCN-

[Fe(SCN)]2+H2O2

[TiO·H2O2]2+缺点：生成的配合物不稳定，灵敏度和选择性较差。有机显色剂:

与金属离子能形成稳定的有色配合物，具有很高的灵敏度和选择性。34有机显色剂

CH3－C－C－CH3HO－NN－OH＝＝NNOHCOOHSO3HOO型：NNNOH

OHON型：PARNHNHNSNS型：双硫腙NN型：丁二酮肟邻二氮菲磺基水杨酸35显色反应的选择*灵敏度高，一般ε>104*选择性好*显色剂在测定波长处无明显吸收。

对照性好,

λmax>60nm.*反应生成的有色化合物组成恒定，稳定。*显色条件易于控制，重现性好。368.3.2显色条件的确定c(R)c(R)c(R)1.显色剂用量（c(M)、pH一定）Mo(SCN)32+

浅红Mo(SCN)5

橙红Mo(SCN)6-浅红Fe(SCN)n3-n拐点372.显色反应酸度（c(M)、c(R)一定）pH1<pH<pH2pH383.显色温度及显色时间另外，还有介质条件、有机溶剂、表面活性剂等T1(℃)T2(℃)t(min)A398.3.3干扰及消除Co2＋,Fe3+Co2+FeF63-Co(SCN)2(蓝)⑴NaFSCN－Co2+Fe2+,Sn4+(2)Sn2+Co(SCN)2SCN－测Co2＋(含Fe3+):(掩蔽法)1.化学法40Co2+,Zn2+,Ni2+,Fe2+

CoR,ZnR

NiR,FeRCoR,Zn2+

,Ni2+

,Fe2+

钴试剂RH+测Co2＋

:(生成络合物性质不同)如不能通过控制酸度和掩蔽的办法消除干扰，则需采取分离法。测Fe3＋:(控制pH)Fe3+,Cu2+FeSS

（紫红）Cu2+pH2.5SS412.物理法—选择适当的测定波长515655415500钍-偶氮砷III

钴-亚硝基红盐

AA络合物络合物试剂试剂42

1.仅络合物有吸收，待测液没有吸收，溶剂（水）作参比。

如phen—Fe2+

标准曲线2.待测液也有吸收，待测液作参比。

如测汽水中的Fe3.显色剂或其他试剂也有吸收，空白溶液作参比

例:邻二氮菲光度法测Li2CO3中的Fe，

参比溶液为不含Li2CO3样品的所有试剂。4.干扰组分与显色剂有反应,又无法掩蔽消除时：

1）掩蔽被测组分，再加入显色剂，作参比.2）加入等量干扰组分到空白溶液中,作参比.

--选择适当的参比溶液438.4吸光光度法定量方法1、绝对法2、标准对照法

C样＝A样/A标·C标3、比吸收法

含量＝E样/E标·C标A＝abc4、标准曲线法

01234mg/mlA。。。。*0.80.60.40.20448.5吸光光度法的应用1.单一组分测定1)金属离子:Fe-phen,Ni-丁二酮肟,Co-钴试剂2)磷的测定:DNA中含P～9.2%,RNA中含P～9.5%,

可得核酸量.H3PO4+12(NH4)2MoO4+21HNO3=(NH4)3PO4·12MoO3+12NH4NO3+12H2O磷钼黄(

小)磷钼(V)蓝(

大)Sn2+453)蛋白质测定—溴甲酚绿、考马司亮蓝等4)氨基酸测定—茚三酮(紫色化合物)5)水质检测:NH4+、NO2-、Mn2+、Fe2+、SO42-、Hg2+----6)药物含量测定—比吸光系数定量；荷移光谱法测定.7)紫外吸收(UV):NO2-、NO3-、SO42-、SO32-、CO32-、SCN-、酪氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、蛋白质等。462.多组分的测定

xl1,eyl1,exl2,eyl2由x,y标液在

1,

2处分别测得在

1处测组分x,在

2处测组分yb)在

1处测组分x;在

2处测总吸收,扣除x吸收,可求yc)x,y组分不能直接测定

A1=exl1bcx+eyl1bcy(在

1处测得A1)

A2=exl2bcx+eyl2bcy(在

2处测得A2)473.络合物组成的测定(1)摩尔比法:固定cM,改变cR

1:13:1c(R)/c(M)A1.02.03,0

48(2)等摩尔连续变化法:M:R=1:10.50.33cM/ccM/cM:R=1:249表观形成常数的测定(设M、R均无吸收)0.5cM/cM:R=1:1A0Ac(M)=c(R)=cMmRn型?508.6应用实例518.6.1天然水中Fe2+的测定邻