神经生物学第二章-神经生物学研究的方法

课程成绩评定平时出勤20%平时作业20%：翻译一篇1500-2000字较新的有关神经生物学领域的英文小专论文或段落，自己查找觉得有意思的素材，10月28日交电子版（发至liuyanq2@126.com)和纸质版，附上英文原文。期末考试(笔试)60%第二章神经生物学研究的方法和手段一、形态学方法二、生理学方法三、电生理学方法四、生物化学方法五、分子生物学方法六、脑成像（Brainimaging）技术一、形态学方法

束（通）路追踪法荧光组织化学法原位杂交法受体定位法神经系功能活动形态定位法

1、束（通）路追踪法：研究神经元之间的联系

轴浆运输法—利用神经元轴浆运输现象的追踪法。

追踪剂：辣根过氧化物酶(horseradishperoxoidase,HRP)荧光染料：核黄(nuclearyellow)

固蓝(fastblue)

荧光金(fluorogold)植物凝集素如麦芽凝集素(wheatgermagglutinin,WGA)和菜豆凝集素(phaseolusvulgarisagglutinin)细菌毒素如霍乱毒素病毒如活的神经病毒

(胞疹病毒和弹状病毒）

变性法：利用神经元包体受损或神经轴突离断后远侧轴突的变性，或轴突切断后细胞的反应，来研究纤维的联系。

*物理性方法：刀的切割、电凝、电离破坏、超声破坏等。

*化学性破坏：兴奋性氨基酸（海人酸和鹅高蕈氨酸）

单胺类神经毒（６－羟多巴胺、６－羟多巴、双羟色胺）神经元质膜荧光染料法：用羰花青（carbocynine）荧光染料，可以染出神经细胞的质膜，并可以在活体或固定的标本上追踪纤维联系。

２、免疫组织化学法

用特异性抗体显示神经组织化学成分的方法。

基本过程有：固定、制片、反应等三步。l

免疫组织化学反应：有直接法和间接法l双重免疫组织化学染色：主要是为了研究两种物质在同一细胞或突起内的共存现象，或两种不同化学物质的相互关系。免疫组化的类型:直接法和间接法

３、原位杂交法

在形态学研究中，主要用于显示细胞内功能蛋白或多肽的mRNA。

４、受体定位法：研究受体在神经系统内的定位

配体法：主要在组织切片上进行，利用标记的配体和受体结合以示踪其部位

免疫组织化学法：用针对受体的抗体

原位杂交法

:受体的mRNA５、神经系功能活动形态定位法

脱氧葡萄糖法：原理是：神经元活动时其能量主要依赖葡萄糖提供。在脑内存在脱氧葡萄糖(2-deoxy-D-glucose，2DG，用于抗病毒的药物)时，神经元可不加区别地将2DG与葡萄糖一起摄入细胞内，两者都是己糖激酶的底物。但2DG在其被磷酸化成2DG-6-PO4后，不能被磷酸己糖异构酶进一步转化为果糖-6-PO4，不能继续在糖酵解循环中代谢。

如在2DG上标以同位素。神经元内同位素的堆积程度反映了神经元的活动程度。

c-fos(Fos)法：

c-fos是一种原癌基因，属于即刻－早期基因(immediate-earlygene)。很多刺激条件可通过第二信使引起神经元c-fos的表达增加，形成fosmRNA。由fosmRNA翻译成的Fos蛋白，立即转位至细胞核内，与另一即刻早基因c-jun

所产生的蛋白Jun构成二聚体（第三信使），调节其靶基因的表达，引起一系列的细胞反应。

细胞色素氧化酶法：

神经元线粒体内的细胞色素氧化酶是提供神经元能量的重要酶，细胞色素氧化酶的水平与神经元能量需求密切相关，一般反映慢性刺激的结果。

二、生理学方法

损毁法

刺激法周身给药法脑室注射法脑组织培养亚细胞分析神经递质释放量的测定

神经递质的功能测定

行为学方法

1、神经递质释放量的测定（在体invivo和离体invitro)推挽灌流法：

在体研究中枢核团递质释放的有用方法。通过推挽灌流套管，使灌流液直接灌流脑组织，从流出液中分析神经递质的变化。

脑透析术(braindialysis)：在特定的脑区内，植入透析探头，用生理溶液灌流时，细胞外液中的神经递质可顺浓度递度从透析管扩散至灌流液中，收集和测定灌流液中神经递质的含量，就能监测该递质的变化过程。

脑透析术的装置包括:

探头导管微量灌流泵样品收集器定量分析仪

抗体微探针法：是在玻璃微电极上涂上一层神经肽抗体，用于在中枢神经系统内定位神经肽的释放。硼硅玻璃与r－氨丙基三乙氧硅烷（r-aminopropyltri-etriethoxysilane）反应后在玻璃表面形成一层带有游离氨基的硅氧烷(siloxane)多聚体微粒。该玻璃再用戊二醛(glutaraldehyde)处理，使戊二醛与蛋白质A以共价键方式偶联，蛋白质A再与神经肽抗体结合，制成抗体微探针脑片灌流法和突触体灌流法2、神经递质的功能测定

微电泳：能将微量的神经递质导入神经元附近，观察其作用。抗体微量注射：特异性的抗体注射在某些部位，可中和神经末梢释放出而进入突触间隙的神经肽，防止其与受体结合。因此，抗体微量注射所引起的功能变化可解释为消除该神经肽的生理效应的结果。生物检测（Bioassay）:经典的方法.如用水蛭背最长肌测定ACh

的作用，灵敏度达10-10g.3、行为学方法

l

经典条件反射：代表刺激与强化的关系。l操作式条件反射：是通过动物自身的某个特定操作动作而获得食物或回避有害刺激的反应活动。

三、电生理学方法

1、电生理常用仪器

生物电放大器

电子刺激器

显示、贮存和分析电生理实验结果的仪器：如示波器照相机和计算机。2、电生理学的常用方法

细胞外记录(Extracellularrecording)：把引导电极安放在神经组织的表面或附近引导神经组织的电活动。胞内记录(Intracellularrecording)：研究神经元基本生物物理特性的有力手段。EPSP，IPSP，AP(动作电位)脑内电刺激：是研究中枢功能定位的方法之一。

顺行冲动记录法(Orthodromicimpulserecording)：就是电刺激某一突触前的细胞体、树突或轴突，在此突触后神经元细胞体上记录此刺激引起的电活动变化。逆行冲动记录法(Antidromicimpulserecording)：逆行冲动记录法即电刺激神经元的轴突主干或末梢，在同一神经元胞体记录反相传导的动作电位。

电压钳技术(VoltageClamp)：通过插入细胞内的一根微电极向细胞内补充电流，补充的电流量正好等于跨膜流出的反向离子流，这样即使膜通透性发生改变时，也能控制膜电位数值的不变。

经过离子通道的离子流与经微电极施加的电流方向相反，数量相等。

SG:信号发生器，AFB:反馈放大器，V:监测膜电位膜(斑)片钳技术（PatchClamp）：可以从分子水平研究细胞膜离子通道的功能。用玻璃微电极与只含１～３个离子通道，面积为几个平方微米的细胞膜通过负压吸引封接起来，由于电极尖端与细胞膜的高阻封接，此片膜内开放所产生的电流流进玻璃吸管，用一极敏感的电流监视器（斑片钳放大器）测量此电流强度，就代表单一离子通道电流。

脑电波测定:

用双极或单极引导法，将引导电极放在脑活动区颅骨表面之上，可以记录出能变换方向的微弱电流。通过强力放大记录出来的电位称脑电图（ＥＥＧ）。

诱发电位:

中枢神经的任何部位对于故意刺激感受器官、感受神经、感觉通路上的任何一点，或与感觉器官有关的任何结构上的一点，所产生的电变化，叫做诱发电位（evokedpotential)。

四、生物化学方法

1、用离心法分离制备突触小体及突出小体膜突触小体:是指脑组织在等渗溶液中匀浆时，神经末梢的细胞膜从轴突上自发断裂、封闭而形成的神经末梢单位。它包括突触前膜、突触后膜及致密斑和包围在突触前膜的突触小泡(vesicle内含神经递质)，线粒体及胞浆蛋白质。

由于突触小体是神经介质及受体的主要聚集部位，突触小体的制备便成了神经介质及受体的基本制备手段。

2、层析法:

特点：分离生物活性物质时不使其失活，可大量制备。基本原理：被分离物质与支持物相互作用的紧密程度不同，流洗时被洗脱的难易程度不同。

离子交换层析

分子筛层析或凝胶过滤

疏水性层析法

亲和层析法

羟磷灰石层析法

高效液相层析

3、放射免疫(radioimmunoassay，RIA)测定神经介质：利用抗体(Ab)特异地识别其抗原（Ag）的原理，将抗原标记放射性同位素（*Ag），用来测定与*Ag抗原性相同的物质

*Ag+Ab*Ag.Ab+Ag↓↑Ag.Ab?

当*Ag固定时，Ag含量越高，所得到的*Ag.Ab就越少。所用仪器：r-计数器，液体闪烁计数仪4、放射受体测定受体法

利用标记能作用于不同靶组织内各种受体的递质和激素，从而达到直接测定配体与其受体形成络合物的过程和理化特性。5、免疫印迹法（immunoblotting

或westernblotting）鉴定生物分子将电泳凝胶分离出来的电泳带移到特殊的滤膜上，再利用标记抗体与滤膜上某一蛋白质或肽的特异结合，使其显色。优点：一是将传统的电泳凝胶染色法的敏感度提高了100~1000倍，二是与RIA相似，能从多种蛋白质中选择鉴定出一种特异的蛋白质，其敏感性可达1ng，同时能知道这一蛋白质的分子量，这又是RIA无法达到的。五、分子生物学方法

１、神经生物学研究中常用的分子生物学方法基因的分子克隆克隆后的基因在人工体外表达系统或细胞中的表达克隆后的基因作为探针研究基因表达的组织特异性和发育阶段特异性研究基因转录调控区的结构特征有助于理解基因转录调控机制

2、聚合酶链反应（PCR）：在神经生物学研究中有广泛的用途，如可应用它发现和分析新基因，测定mRNA

３、反向遗传学利用制造体内基因突变的方法研究基因及其产物的功能：通过制造定向突变改变生物表型的方法与传统遗传学所采用的通过生物表型确定其基因型的方法相反，故称反向遗传学。

４、遗传连锁分析法分离遗传病基因：人类基因组由23条染色体组成，基因组内大约包含5~10万个基因，其中40%在脑内表达。约有1000多种遗传病具有明显的中枢神经系统症状，占已知遗传病总数的三分之一。

六、脑成像（Brainimaging）技术

利用各种方法和技术来摄取人及动物颅骨和颅内组织结构的影像，从而了解其是否异常的技术。可以反映:

颅骨的密质差异、颅腔以及其他邻近结构在无损伤的情况下观察大脑的结构和功能；对大脑损伤或病变部位进行精确的定位。

1、颅骨X射线照相术：以基本的X射线设备和X射线照像技术即可获得颅骨的X射线照片。２、同位素脑扫描(Isotopebrainsc