PCR原理完整版本

聚合酶链式反应（PCR）

原理及引物设计逆转录PCR(RT-PCR)先以RNA为模板，在逆转录酶作用下合成cDNA；然后以cDNA为模板，在DNA聚合酶的作用下扩增特定目的基因通常用于检测特定基因mRNA在样本中的表达水平PCR反应分为三步：DNA模板变性(denaturing)在93-95℃之间使模板充分变性单链DNA模板与引物退火(annealling)55℃左右，此温度选择根据模板和引物配对结合强弱而定，是反应特异性的决定因素之一引物延伸(extension)70-72℃左右，为Taq酶最适反应温度。PCR法的操作过程Step1:

DNA热变性Step2:

引物退火Step3:

引物延伸5572经典循环参数（500bp以内）94℃30s50℃45s72℃1min94℃5min×30次72℃10min4℃foreverPCR反应五要素：●模板DNA：50-200ng，高纯度，增加反应特异性●PCR用引物：根据目的基因两侧特定序列设计。约

20bp左右；Ｇ＋Ｃ含量在45-55％之间；内部不能有回文序列；３’端不能互补。●PCR用DNA聚合酶：嗜热杆菌、耐热95℃●PCR用Buffer：Mg2+是辅基（2.0-3.0mM）浓度太低酶活力降低；太高反应特异性降低。●dNTP：100μM～200μM实时荧光定量PCR

(RealtimeQuantitativePCR)在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号累积实现了实时监测整个PCR进程，对起始模板进行定量分析的方法。

与普通RT-PCR的区别

普通RT-PCR技术：在PCR结束后对终点产物进行定量分析。实时定量PCR技术：实时检测PCR扩增，在扩增的指数期对起始模板进行定量。

荧光定量PCR化学原理

1、非特异性荧光标记：SYBRGreen、FAM等荧光基团

2、特异性荧光标记：TaqMan探针1、SYBRGreen法SYBRGreen熔解曲线分析

PCR引物设计引物的重要性在整个PCR体系中,引物占有十分重要的地位。PCR的特异性要求引物与靶DNA特异结合，不与其他非目的DNA结合，PCR的灵敏性要求DNA聚合酶能对引物进行有效的延伸，可见引物设计好坏与PCR结果密切相关。引物设计原则引物长度碱基分布的均衡性Tm值引物二级结构引物3’端引物5’端引物的内部稳定性引物的保守性与特异性扩增区域的二级结构引物长度一般为15-30个核苷酸，在做长片段PCR或做某些特殊的PCR时使用较长的引物，但最多不超过70个核苷酸。碱基分布的均衡性同一碱基连续出现不应超过5个GC含量一般40-60%GC含量太低导致引物Tm值较低，使用较低的退火温度不利于提高PCR的特异性GC含量太高也易于引发非特异扩增。引物Tm值一般要求：55℃-65℃。计算：对于低于20个碱基的引物，Tm值可根据Tm=4(G+C)+2(A+T)来粗略估算对于较长引物，Tm值则需要考虑热动力学参数，从“最近邻位”的计算方式得到，这也是现有的引物设计软件最常用的计算方式。Tm=△H/(△S+R*ln(C/4))+16.6log([K+]/(1+0.7[K+]))-273.15

引物二级结构引物二聚体尽可能避免两个引物分子之间3’端有有较多碱基互补发夹结构尤其是要避免引物3’端形成发夹结构，否则将严重影响DNA聚合酶的延伸。引物3’端引物的延伸从3’端开始，因此3’端的几个碱基与模板DNA均需严格配对，不能进行任何修饰，否则不能进行有效的延伸，甚至导致PCR扩增完全失败。引物5’端引物5’端可以有与模板DNA不配对碱基，在5’端引入一段非模板依赖性序列。5’端加上限制性核酸内切酶位点序列（酶切位点5’端加上适当数量的保护碱基）。5’端的某一位点修改某个碱基，人为地在产物中引入该位点的点突变以作研究。5’端标记放射性元素或非放射性物质（如生物素、地高辛等）。引物的内部稳定性过去认为，引物3’端应牢牢结合在模板上才能有效地进行延伸，故3’端最好为G或C。现在的观点认为，引物的5’端应是相对稳定结构，而3’端在碱基配对的情况下最好为低稳定性结构，即3’端尽可能选用A或T，少用G或C。仅仅3’端几个碱基与非特异位点上的碱基形成的低稳定性结构是难以有效引发引物延伸的。如果3’端为富含G、C的结构，只需3’端几个碱基与模板互补结合，就可能引发延伸，造成假引发。引物的保守性与特异性通用引物保守性：检测同一类病原微生物尽可能多的型别特异性：避免非特异性扩增引物浓度与PCR引物浓度：一般为0.1-0.5umol/L简单的配算方法：配置贮存浓度为50μM引物需要的体积=（nmol数×20）μl上下游引物各取20μl+60μl水=10μM的混合引物50μlPCR反应体系中加入1μl浓度为10μM的混合引物即可(反应浓度为0.2umol/L)引物与PCR退火温度退火温度最适退火温度（TaOpt）=0.3×(Tmofprimer)+0.7×(Tmofproduct)–25一般采用较引物Tm值低5℃作为PCR退火温度。条件允许的情况下，可以通过梯度PCR摸索最适退火温度引物设计软件NCBIPrimerBLASTPrimer3OligoPrimerPremier5.0ThePrimerGeneratorNetPrimerPrimerPremier5.0使用介绍PreimerPremier启动界面Loadsequence基本信息SequencenameOriginalsequenceUsethesetwobuttontotranslatetheDNAseqtoaproteinseqoraproteinseqtoaDANseq8种密码子偏好Chooseafunction引物设计界面FirstyoucandesigntheprimermanuallySensestrandoranti-sensestrandUsefulinformationoftheprimer引物搜索选项设定引物类型搜索模式5’引物位置范围3’引物位置范围产物大小范围引物长度搜索结果28对引物引物分值100分为满分每对引物的信息双击选中一对引物引物信息回到主窗口引物及产物信息是否出现hairpin,dimer,falseprimingandcrossdimer引物编辑引物编辑EditprimerhereAnalysistheeditresultAcceptth