儿童过敏性紫癜相关基因表达谱研究课件

儿童过敏性紫癜相关基因表达谱研究儿童过敏性紫癜相关基因表达谱研究儿童过敏性紫癜相关基因表达谱研究研究背景

过敏性紫癜(HSP)是儿童时期最常见的以小血管炎症为主要病变的系统性血管炎，以皮肤紫癜、胃肠道症状、关节肿痛、肾脏损害为主要临床表现儿童过敏性紫癜相关基因表达谱研究

HSP发病率有逐年增多趋势江西省儿童医院每年收治新发HSP住院人数研究背景儿童过敏性紫癜相关基因表达谱研究皮疹反复出现暴发性、坏死性皮肤紫癜肾脏损伤严重的胃肠道大出血新发病例严重肾脏损伤者逐渐增多

紫癜性肾炎占儿童继发性肾脏疾病第一位儿童时期终末期肾脏病的主要原因

研究背景儿童过敏性紫癜相关基因表达谱研究

HSP患儿肾脏是否受累及受累程度是决定其预后的最主要因素

肾脏损伤在过敏性紫癜中的发生率达30％～50％研究背景儿童过敏性紫癜相关基因表达谱研究病因及发病机制仍未完全阐明临床上尚缺乏有效的治疗措施加强对过敏性紫癜发病机制、特别是分子发病机制的研究以试图寻找更科学、更有效的治疗方法来控制其进一步发生与发展成为广大儿肾工作者努力的方向研究背景儿童过敏性紫癜相关基因表达谱研究

许多研究者、临床工作者均在努力寻找能够减少HSP疾病发生、导致肾损害的各种因素，以期能指导临床治疗，改善HSP的预后儿童过敏性紫癜相关基因表达谱研究

目前的研究多集中在单一细胞因子或者单一基因在过敏性紫癜发病及进展中的作用和关系上血清中IL-6、TNF-α水平能够反映HSP患儿的疾病严重程度

LinCY,YangYH,LeeCC,etal.Thrombopoietinandinterleukin-6levelsinHenoch-Schönleinpurpura[J].JMicrobiolImmunolInfect,2006;39(6):476-82

HSP患儿血清VCAM-1水平与HSP患儿的疾病严重程度有关

傅睿，胡宝金，等.可溶性血管细胞粘附分子1（sVCAM-1）在紫癜性肾炎发病中的作用探讨[J].中国免疫学杂志，2003；19（2）：129－131.

研究现状儿童过敏性紫癜相关基因表达谱研究基因多态性及表达异常与HSP的易感性、肾损伤进展、预后有相关性

人类白细胞抗原(HLA)-DQAI、HIA-B35、HLA–DRBI肾素-血管紧张素系统(RAS)基因细胞毒性T细胞相关蛋白4基因

家族性地中海基因

C4基因、PAX2

只是从某一方面反映了其中某些单一因素在过敏性紫癜发病中的作用只是针对一个或几个基因进行研究，无法达到对基因网络化、高通量分析的要求

儿童过敏性紫癜相关基因表达谱研究我科开展的课题血管细胞粘附分子-1(VCAM-1)在紫癜性肾炎发病中的作用及其临床意义的研究巨噬细胞移动抑制因子在紫癜性肾炎发病中作用及意义巨噬细胞移动抑制因子-173G/C基因多态性与紫癜性肾炎发病的关系足细胞蛋白Podocalyxin在紫癜性肾炎发病机制中的研究松弛素与儿童过敏性紫癜复发及肾损害关系的研究免疫吸附血液灌流技术在儿童重症过敏性紫癜中的临床应用

儿童过敏性紫癜相关基因表达谱研究问题目前研究手段的局限性及单一方面性参与HSP发生、发展过程中的主要基因导致HSP患儿肾损伤的基因

目前并不十分清楚，需要更先进的研究方法儿童过敏性紫癜相关基因表达谱研究基因芯片技术提供研究平台

将几千个基因特异的探针或其cDNA片断固定在载体上能够高通量、准确、快速同时进行成千上万条基因表达的测定

对来源于不同个体、不同组织、不同细胞周期、不同发育阶段、不同分化阶段、不同病变、不同刺激下的细胞内的mRNA或逆转录产物cDNA进行检测大规模对这些基因表达的个体特异性、组织特异性、发育阶段特异性、分化阶段特异性、病变特异性、刺激特异性进行综合分析和判断疾病的诊断、鉴别诊断、治疗药物选择、预后判断儿童过敏性紫癜相关基因表达谱研究基因芯片技术在肾脏疾病诊断和治疗中的应用儿童肾病综合征基因表达谱分析系统性红斑狼疮Alport综合征UUO大鼠肾间质纤维化的分子机制糖尿病肾病大鼠儿童过敏性紫癜相关基因表达谱研究研究内容及目的

利用基因芯片技术检测HSP患儿外周血、HSPN患儿肾组织基因表达谱，以正常儿童外周血及正常肾组织基因表达谱为对照，对差异表达基因进行生物信息学分析，筛选出HSP患儿疾病发生及肾损伤相关基因，以探讨HSP发生、发展的分子机制

儿童过敏性紫癜相关基因表达谱研究研究对象病例组：HSP患儿6例，根据有无尿改变分为非肾损伤组(NHSPN)3例，肾损伤组(HSPN)3例。对照组：选取年龄、性别与病例组相匹配的3例健康体检儿童外周血；正常肾组织1例来自肾肿瘤切除术后远离肿瘤的正常肾组织。

HSP诊断符合《实用儿科学》第7版中HSP的诊断标准。HSPN诊断符合中华医学会儿科分会肾脏病学组制定的诊断标准。

儿童过敏性紫癜相关基因表达谱研究对照组NHSPN组HSPN组外周血或肾组织治疗前及病情缓解2周后留取外周血治疗前外周血及肾组织外周血及肾组织总RNA抽提及鉴定cDNAmicroarray芯片制备及杂交信号扫描和分析RT-PCR法芯片结果验证实验结果用SPSS10.0软件进行统计学分析研究方法及技术路线儿童过敏性紫癜相关基因表达谱研究

研究结果与讨论总RNA质量检测

芯片数据评估

芯片结果

儿童过敏性紫癜相关基因表达谱研究总RNA质量检测

总RNA经生物分光光度计检测，OD230/OD260/OD280比值均接近1:2:1琼脂糖凝胶电泳图均可以清晰地看到5S、18S和28S条带，亮度28S:18S接近2:1

说明所提取的总RNA完整性好、纯度高，质量符合表达谱芯片实验要求儿童过敏性紫癜相关基因表达谱研究芯片数据评估

芯片荧光信号扫描图：芯片信号强度高且均一，基因点清晰，没有基因点漏点、点重叠以及不正常荧光的情况

儿童过敏性紫癜相关基因表达谱研究

对原始数据进行标准化后作Box-Plot图：所有样本的信号分布几乎是相同的，无明显差异，均可用于进一步数据分析

儿童过敏性紫癜相关基因表达谱研究

散点图：形象化评估两个比较组间的基因表达差异，X/Y轴是每个样本的标准化信号值（log2形式），绿色线是折叠变化线，在顶面绿色线以上和底下绿色线以下的基因代表两个比较组间的差异表达基因儿童过敏性紫癜相关基因表达谱研究

层次分析聚类：将具有相似表达谱的样品聚集到一类，可以检测同一类样本之间重复性。本研究样本各组能聚到一类,说明同一类样本间的重复性良好儿童过敏性紫癜相关基因表达谱研究芯片结果

组间差异表达基因筛选标准：火山图（VolcanoPlots）：两条垂直线代表上下调1.5倍，水平线代表T检验P值＜0.05，图中红点代表具有统计学意义的差异表达基因儿童过敏性紫癜相关基因表达谱研究单纯过敏性紫癜组与对照组间共有1064条差异表达基因，其中上调基因661条，下调基因403条，Pathway分析共有21条通路发生显著性异常改变儿童过敏性紫癜相关基因表达谱研究单纯过敏性紫癜组与对照组部分上调差异表达基因GENE-IDGENE-NAME

基因描述GO生物过程51286BM88BM88抗原无注释7077TIMP2组织金属蛋白酶抑制剂2细胞增殖64129TINAGL1小管间质性肾炎抗原样1炎症/免疫114904C1QTNF6补体C1Q肿瘤坏死蛋白6无注释30835CD209CD209分子炎症/免疫163702IL28RA白细胞介素28受体α（​​干扰素λ受体）信号转导炎症/免疫5228PGF胎盘生长因子，血管内皮生长因子相关蛋白信号转导4485MST1巨噬细胞刺激1（类肝细胞生长因子）蛋白水解儿童过敏性紫癜相关基因表达谱研究

单纯过敏性紫癜组与对照组部分下调差异表达基因GENE-IDNAME

基因描述GO生物过程3428IFI16干扰素γ诱导蛋白16炎症/免疫、细胞增殖/分化、转录25816TNFAIP8肿瘤坏死因子，α-诱导蛋白8凋亡的调控9516LITAF脂多糖诱导肿瘤坏死因子凋亡、转录调控8743TNFSF10肿瘤坏死因子（配体）超家族成员10凋亡、免疫、信号传导3002GZMB

颗粒酶B（颗粒酶2，细胞毒性T淋巴细胞相关丝氨酸酯酶1）蛋白水解、细胞凋亡/溶解313AOAHacyloxyacyl水解酶（中性粒细胞）炎症/免疫、代谢5993RFX5调控因子X，5（影响人类白细胞抗原II类的表达）转录调节10588MTHFS5,10甲酰四氢叶酸合成酶（5-甲酰四氢叶酸环连接酶）代谢儿童过敏性紫癜相关基因表达谱研究上调基因（661条）较下调基因（403条）多，HSP差异基因上调为主涉及目前在HSP发生发展中已被认识的基因如：粘附分子类（BCAM、CEACAM1、CEACAM3、GLYCAM1）、补体及细胞因子（C1QC、C1QTNF6、C1QTNF8、CCL21、CD5L、CD209、IL28RA、IL31RA、IL5RA、MST1、TNFRSF6B、HIF3A）、血类管紧张素Ⅱ受体1（AGTRL1）等涉及一些未被认识的可能参与HSP发生过程的基因如：抗原（BM88）、防御β126(DEFB126)、颗粒酶B(GZMB)、AOAH、调控因子（RFX5）等

单纯过敏性紫癜组与对照组间差异表达基因儿童过敏性紫癜相关基因表达谱研究紫癜性肾炎组与单纯过敏性紫癜组间共有830条差异表达基因，其中上调基因385条，下调基因445条，Pathway分析共有49条通路发生显著性异常改变儿童过敏性紫癜相关基因表达谱研究紫癜性肾炎与单纯过敏性紫癜组部分上调差异表达基因GENE-IDNAME

基因描述GO生物过程1879EBF早期B细胞因子转录调控9242ABF1/MSC激活的B细胞因子1转录调控3108HLA-DMA主要组织相容性复合体II类DMα炎症/免疫3123HLA-DRB1主要组织相容性复合体Ⅱ类DRβ1炎症/免疫7423VEGFB血管内皮生长因子β

细胞增殖、信号转导7048TGFBR2

转化生长因子β受体II（70/80kDa）信号通路、细胞增殖6648SOD2超氧化物歧化酶2氧化应激、代谢、转录调控7127TNFAIP2肿瘤坏死因子α-诱导蛋白2血管发生、细胞分化儿童过敏性紫癜相关基因表达谱研究紫癜性肾炎与单纯过敏性紫癜组部分下调差异表达基因GENE-IDNAME基因描述GO生物过程2161F12凝血因子XII血液凝固、纤溶3336HSPE1热休克10KD蛋白1蛋白质折叠3324HSP90AA2热休克蛋白90kDaα（胞质），A类成员2无注释3070HELLS解旋酶，淋巴特定转录、有丝分裂2887GRB10生长因子受体10细胞内的信号级联、胰岛素受体信号转导通路3609ILF3白细胞介素增强子结合因子3转录、调控2574GAGE2G抗原2无注释2576GAGE4G抗原4无注释儿童过敏性紫癜相关基因表达谱研究紫癜性肾炎组与单纯过敏性紫癜组间差异表达基因上调（385条）较下调（445条)少其中凝血因子12（F12）、热休克10KD蛋白1（HSPE1）、HSP90AA2、MTHFS、G抗原2/4/6(GAGE2/4/6)、生长因子受体10（GRB10）、白细胞介素增强子结合因子3（ILF3）等基因上调倍数大于2.5倍HLA-DMA/DRB1、早期B细胞因子（EBF）、SOD2、TGFBR2、激活的B细胞因子1（ABF1）、干扰素-γ诱导蛋白16（