DB34T∕ 2785-2016 油菜抗根肿病人工接种鉴定技术规程

油菜抗根肿病人工接种鉴定技术规程TechnicalRegulationsforArtificialInoculationofHYPERLINK安徽省质量技术监督局发布I本标准根据GB/T1.1-2009给出的规则起草。本标准由安徽省农业科学院作物研究所提出。本标准由安徽省农业标准化技术委员会归口。本标准主要起草单位：安徽省农业科学院作物研究所。本标准参与起草单位：安徽省黄山市农业科学研究所。本标准主要起草人：费维新、胡宝成、李强生、侯树敏、陈凤祥、荣松柏、王淑芬、初明光、江莹芬、郝仲萍。1油菜抗根肿病人工接种鉴定技术规程本标准规定了油菜品种根肿病抗性鉴定依据、实验菌株的扩繁与保存、育苗基质的配置、接种液的制备、接种苗的培养、人工接种技术和抗性评价方法等。本标准适用于油菜品种资源根肿病的抗性鉴定及评价。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB15981消毒与灭菌效果的评价方法与标准SN/T2632微生物菌种常规保藏技术规程3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。一种能够被病原菌侵染并引起病害的生物体。病原菌株pathogenicisolate从植物发病部位通过人工培养、纯化、再接种和分离等方法获得的病原菌的分离培养物。3.3休眠孢子悬浮液restingsporessuspension病菌休眠孢子均匀分散于水中不下沉，与水混合形成孢子悬浮液。接种浓度inoculumsconcentration用于人工接种的单位体积内病菌休眠孢子的数量。2DB34/T2785—根肿病clubrootdiseasePlasmodiophoromycetes,根肿菌目Plasmodiophorales。由Plasmodiophorabrassicae病菌侵染引苗期油菜根肿病分级标推详见附豪流使用，请勿传播或其他用途电子天平(感量0.01g),移液器，离心管，吸管，三角瓶，医用血球计，育苗盘及托盘。6主要试剂与材料75%乙醇酒精，浓盐酸，根肿菌的主要致病生理小种病原菌株，油菜根肿病感病对照品种Westar和抗病对照品种Mendel,泥炭土，蛭石，珍珠岩。37实验菌株的扩繁实验用菌株用油菜感病品种Westar或速生2号接种扩繁，方法同人工接种，接种后60天(d)收获肿根，并用自来水洗净后登记繁殖寄主品种、生理小种类型、日期、人员等信息，并于-20℃冰箱储存备用。8育苗基质的配置使用的营养基质为接种用专用配方土，主要成分为泥炭土、蛭石、珍珠岩，并按照体积比1:1:1均匀混合。在使用前将配置的营养基质先用高压灭菌锅灭菌处理(121℃,30min),参照GB15981标准；然后将灭菌的营养基质分装入50孔(每孔100ml)的育苗盘中，接种前营养土用自来水浇透，并放在配套的托盘上。9接种液的制备从冰柜中取出储藏在-20℃下的一个油菜肿根(30g左右),置于室温下1小时(h),将解冻软化后的肿根放入粉碎搅拌机(型号JYL-C16D,功率250W)中，加入100ml的无菌去离子水(ddH₂O)搅拌粉碎(转数为18000～22000r/min),水质参照GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法；待肿根充分粉碎后，获取的肿根粉碎搅拌混合液用8层纱布过滤，得到根肿菌休眠孢子悬浮液在50g离心5min,收集上清液(含有休眠孢子),再从上清液中取样1ml稀释10倍，用医用血球计数板检查根肿菌休眠孢子数量并计算休眠孢子的浓度，然后在三角瓶标签上标记注明休眠孢子悬浮液的浓度，并置入4℃冰箱中保存备用；人工接种前用ddH₂O将休眠孢子悬浮液的浓度调配到所人工接种需要的接种浓度。10接种苗的准备供接种用的油菜种子需先用75%(v/v)乙醇消毒30秒(s)后用无菌去离子水(ddH₂O)震荡漂洗3次，然后将消毒灭菌处理的种子置入发芽盒的发芽滤纸上催芽，发芽盒并在人工气候箱中培养，设置气候箱条件参数：温度为24℃(光照)/18℃(黑暗),湿度为60%～80%,光周期为16h光照/8h流请勿传播或其他用途11人工接种开始接种工作前提前半天将营养钵中装有的灭菌处理过的营养基质用自来水浇透，接种时将接种苗在接种浓度为1×10⁷个/ml的休眠孢子悬浮液中蘸根5s后栽入营养钵中，每营养钵中栽入1棵接种苗，每个重复接种苗25棵，设4次重复，移栽完毕后用滴管吸取接种浓度为1×10⁷个/ml的休眠孢子悬浮液1ml接种于幼苗根部土壤，接种实验设感病对照和抗病对照。油菜幼苗接种后使用酸水(pH6.0,用浓盐酸配置)浇入托盘中，并将接种苗移入人工气候温室中；油菜幼苗接种后6w调查植株发病情况。12环境条件的控制4DB34/T2785—2016人工接种鉴定试验接种后的苗移入温室中，接种苗需要在人工气候温室中培养6w,温室的控制参数设置：温度为24℃(光照)/18℃(黑暗),湿度为75%～85%,光周期为16h光照/8h黑暗，光照强度为15000～20000Lux。油菜幼苗接种后2w内每隔1天(d)在托盘中浇入酸水(pH6.0,用浓盐酸调制),并保持育苗营养钵中的基质土水分充足，油菜幼苗接种2w以后根据苗情补充水分。13数据采集与结果判定接种后6w调查病害发病，以油菜根肿病为害症状病害分级(0-3级)计算病情指数(diseaseindex,缩写为DI),计算公式(1)如下。DI——病情指数；病级数(0～n);Xi——病情为i级的植株数量；Si——病情为i级的病级代表值；Sn—病情为最高病级代表值。——0<高抗HR≤5;——10<中抗MR≤20;见附录B。14菌株保存与处理分离鉴定的菌株应妥善保存，孢子悬浮液可置于4℃冰箱中临时保存，病原菌株用感病品种Westar扩繁后于零下20℃冰柜中长期保存，每间隔5年(y)用感病品神Westar1促期繁殖。参照SN/T2632对于不需长期保存的菌株应及时采用高压湿热灭菌法灭活处理，参照GB15981标准。15结果记录与资料保存完整的实验记录包括样品的来源、种类、时间，测试的时间、地点、方法和结果，实验人员和审核人员签字。见附录C。5(规范性附录)根部没有附着根肿。1级根部有细小肿瘤，根肿只附着在侧根上，数量占根系全部的1-25%。2级根部有中等肿瘤，主根上有根肿附着，侧根上根肿数量占根系全部25%以上。根部有异常大肿瘤，主根上有根肿附着，根肿数量占50%以上的根系。6(规范性附录)油菜根肿病抗性评价标准表B.1油菜根肿病抗性评价标准病情指数的数值范围免疫Immune(I)5≥病情指数>0高抗HighlyResistant(HR)10≥病情指数>5抗病Resistant(R)20≥病情指数>10中抗ModeratelyResi