高品质免疫类诊断试剂原料的开发与制备

高品质免疫诊断试剂原料的开发与制备杜冰北京义翘神州科技股份有限公司高级研发经理义翘神州简介体外诊断试剂相关概述1免疫类原料的工艺开发流程2免疫类原料开发相关案例3免疫类原料开发的重点与挑战.4义翘神州体外诊断试剂相关概述01义翘神州IVD主要技术分类及市场＊数据来源：

罗氏诊断2019年技术手段全球市场国内市场生化诊断17%20%免疫诊断23%35%分子诊断19%25%POCT20%5%其他21%15%体外诊断的价值IVD占~2%全球医疗支出IVD影响>60%临床医疗关键决策义翘神州2017-2025年全球体外诊断行业市场规模（百万美元）2018-2022年国内体外诊断行业市场规模（百万元）2018-2022年国内免疫诊断细分行业市场规模（百万元）资料来源：中国药品监督管理研究会、高禾投资研究中心IVD行业市场规模及增速义翘神州＊数据参考：

前瞻产业研究院体外诊断产业链上游原材料：抗原/抗体、酶/微球/NC膜/电子元器件高端原料进口为主供应链风险中游产品：诊断试剂诊断仪器高端封闭分级诊疗下游流通竞争格局分散集采压力医院检验科第三方检验/诊断体检中心/防疫站/血站义翘神州IVD国内年复合增长率在10%以上原料开发处于产业链的上游环节高品质的原料对于产品质量的影响很大诊断试剂的灵敏度和特异性基本由原料决定原料的可靠性、稳定性及一致性是产品成功的关键体外诊断原料的总体情况义翘神州免疫类原料的工艺开发流程02义翘神州生化诊断免疫诊断分子诊断POCT

生化酶抗原抗体抗原抗体抗原抗体分子酶扩增酶连接酶反转录酶体外诊断检测方法分类及关键生物原材料义翘神州常见免疫诊断检测平台免疫诊断原料（抗原和抗体）化学发光平台肿瘤、甲功、传染病、激素、心脏标志物、代谢和贫血等POCT平台血气、电解质、炎症、心脏标志物、传染病、糖化血红蛋白免疫比浊平台（生化）免疫球蛋白、补体、载脂蛋白、C-反应蛋白、血清淀粉样蛋白A、降钙素原、铜蓝蛋白等、类风湿因子尿微量白蛋白、微球蛋白、转铁蛋白、白蛋白、前白蛋白等义翘神州表达量低聚集包涵体降解活性表达序列优化表达载体选择转染条件表达宿主选择目的蛋白粗提方案精纯方法获得高纯度蛋白抗原开发中的常见问题重组抗原开发的关键环节义翘神州重组抗原开发技术-表达宿主义翘神州大肠杆菌优点缺点酵母优点缺点昆虫杆状病毒优点缺点哺乳动物优点缺点经济快速高产量最常用难表达大分子蛋白无后修饰包涵体经济快速高产量有后修饰蛋白后修饰高产量高细胞密度可溶蛋白周期长缺少部分糖基化成本高蛋白后修饰可溶蛋白周期长成本高非人源糖基化高甘露糖修饰分泌抗原胞内抗原膜抗原细胞裂解膨胀法去污剂破膜法高压匀浆破碎法超声破碎法固液分离高速离心深层过滤微滤超滤粗纯亲和纯化:镍柱离子交换疏水层析精纯亲和纯化离子交换疏水层析凝胶层析重组抗原开发技术-纯化工艺义翘神州免疫筛选抗体纯化应用鉴定免疫原选择免疫原制备免疫方案剂量、途径、佐剂、周期等高通量多种筛选方法蛋白A/G抗原亲和纯度内毒素WB、IHC、FCM等特异性识别多种天然样本抗体原料开发技术-基本流程义翘神州杂交瘤噬菌体展示文库B细胞Beacon细胞易获得识别天然构象的抗体电融合较PEG融合效率有大幅提升高效的抗体开发技术平台：经典技术优化：电融合，建库技术新技术：单个B细胞技术，更快的速度多种筛选方案组合高效的重组抗体表达重组蛋白优选系统表达（更近天然）核酸无需表达蛋白、节约时间易获得识别天然构象的抗体快速免疫、常规免疫不同免疫部位、剂量、佐剂组合免疫动物多样化：兔、小鼠、山羊、豚鼠高质量的候选抗体库：数百-数千个候选抗体亲和力达到nM-pM水平不同的抗原结合表位适用于不同应用场景四大抗体制备技术平台多种免疫原多种免疫方案抗体原料开发技术-技术平台义翘神州抗体原料开发技术-检测平台组织水平组织水平天然样本细胞裂解液蛋白分子水平CD71（11020-R016）胎盘CD147（10186-R125）食道IHCAnti-CD3-FITC(CT026-R301-F)Anti-CD4-APC(10400-MM008-A)Anti-CD19(11880-MM17)PDXDC1(202952-T46)KLC3(202063-T020)FCMIFELISAE-Cadherin(10204-T52)GSTK1(14291-T52)WBIPBiacore检测Octet检测义翘神州ELISA方法-抗原表位检测胶体金检测时间分辨荧光检测乙型流感检测灵敏度可达到50pg/mLIL-6检测灵敏度可达到10pg/mL抗体原料开发技术-应用检测平台义翘神州T/C值扫描位置大豆Glym4过敏原37℃加速稳定性结果3个批次生产过程一致性高品质产品的保障-稳定性和批间差义翘神州新冠N蛋白抗体生产百分比时间（天）时间（天）活性OD值免疫类原料开发相关案例03义翘神州致敏过程反应过程过敏免疫诊断是检测体内sIgE抗体室内过敏原（宠物、尘螨、霉菌、蟑螂等）室外过敏原（花粉、霉菌等）食物（牛奶、鸡蛋、花生等）注射类过敏原（昆虫、药物等）·国内过敏性患者约2亿（哮喘5000万、过敏性鼻炎1亿）·过敏性疾病发病复合年增长率>20%·吸入类：尘螨>蟑螂>猫毛>艾蒿过敏的概况参考来源：KubyImmunologySixthEdition义翘神州FeldI分子设计异源二聚体两个亚基在同一个表达框内FeldI优化策略MR使用原核系统表达，自然折叠酵母表达有糖基化位点，可能影响活性异源二聚体或者四聚体，且活性较好FeldI产品特点实例1.猫过敏原FeldI开发分子结构DNA序列优化载体选择宿主菌表达条件优化前处理层析填料选择层析流程优化靶点分析重组表达纯化工艺可溶表达90%纯度高活性义翘神州样品测试实例2.重组鸡蛋过敏原Gald1的开发E.coliP.pastoris293cellGald1开发表达量低与sIgE反应弱纯化后3条带与sIgE反应弱条带弥散与sIgE反应良好66.211645.035.025.018.414.4MRNR11666.245.035.025.018.414.4MRNR11666.245.035.025.018.414.4MRNR优选原料表达系统工艺开发义翘神州义翘神州

过敏原货号名称分子尘螨69028-A08HDermatophagoidesfarinaeDERF1Protein(HisTag)Derf169029-A07EDermatophagoidesfarinaeDERF2Protein(HisTag)Derf269007-A08HDermatophagoidespteronyssinusDERP1Protein(HisTag)Derp169014-ANAEDermatophagoidespteronyssinusDERP10ProteinDerp1069005-A07EDermatophagoidespteronyssinusDerp2protein(HisTag)Derp2热带螨69061-A08YBlomiatropicalisBlot1Protein(HisTag)Blot169062-A08HBlomiatropicalisBlot2Protein(HisTag)Blot2狗70257-D08HCanineCanf1Protein(HisTag)Canf1306-CAN0010RecombinantCanisfamiliarisAllergenCanf4Canf4猫301-FELDI0010RecombinantFelisdomesticusallergenFeld1Feld1301-FELDI0030RecombinantFelisdomesticusAllergenFeld4Feld4蟑螂69030-A07EBlattellagermanicaBlag1Protein(HisTag)Blag1320-BLA0010RecombinantCockroachesallergenBlag4Blag4美洲大蠊69031-A08EPeriplanetaamericanaPera1Protein(HisTag)Pera1欧洲白桦69044-A07EBetulapendulaBETV4Protein(HisTag)Betv4335-BET0010RecombinantBetulaverrucosaAllergenBetv2Betv2法国梧桐323-PLA0020RecombinantPlatanusacerifoliaAllergenPlaa1Plaa1323-PLA0030RecombinantPlatanusacerifoliaAllergenPlaa2Plaa2323-PLA0060RecombinantPlatanusacerifoliaAllergenPlaa3.02Plaa3豚草302-AMBA0040RecombinantAmbrosiaartemisiifoliaallergenAmba1Amba1艾蒿69035-A08HArtemisiavulgarisMajorpollenallergenArtv1Protein(HisTag)Artv1324-ART0050RecombinantMugwortAllergenArtv4.02Artv4欧蓍草69050-A08HParietariajudaicaAllergenParj2.0101Protein(HisTag)Parj2梯牧草69047-A07HPhleumpratensePhlp2Protein(HisTag)Phlp269048-A07HPhleumpratensePhlp5Protein(HisTag)Phlp5葎草333-HUM0010RecombinantHumulusscandenAllergenHums1Hums1链袼孢69006-ANAEAlternariaalternateALTA1proteinAlta1烟曲霉69009-A08HNeosartoryafumigataAspf1Protein(HisTag)Aspf1321-ASP0010RecombinantAspergillusFumigatusallergenAspf15Aspf15321-ASP0040RecombinantAspergillusFumigatusallergenAspf22Aspf22附表1：吸入类过敏原义翘神州

过敏原

货号名称分子八大类小麦305-TRIA0020RecombinantwheatallergenTria14Tria14大豆304-GLYM0010RecombinantGlycinemaxallergen4,soybeanGlym4虾318-MET0020RecombinantMetapenaeusensisAllergenMete1Mete1鱼307-GADC0020RecombinantGadusmorhuaallergenGadc1Gadc1蟹308-SCY0110RecombinantScyllaparamamosainallergenScyp1Scyp1鸡蛋322-GAL0030RecombinantGallusGallus(Chicken)allergenGald1Gald1牛奶325-BOS0020RecombinantBosdomesticusAllergenBosd2Bosd2花生303-ARAH0010Recombinant

peanut

allergen

Ara

h

9.0101Arah9核桃314-JUG0010RecombinantJuglansregiaAllergenJugr1Jugr1榛子69057-ANAECorylusavellanaCora1ProteinCora1巴西坚果317-BER0010RecombinantBertholletiaexcelsaAllergenBere1Bere1芝麻319-SES0010RecombinantSesamumindicumallergenSesi1Sesi1水果猕猴桃312-ACT0020RecombinantActinidiadeliciosaAllergenActd8Actd8苹果309-MAL0020RecombinantMalusdomesticaAllergenMald1Mald1草莓311-FRA0020RecombinantFragariaananassaAllergenFraa1Fraa1昆虫蜂蜜329-VES0040RecombinantVespulavulgarisAllergenVesv5Vesv5动物马326-EQU0010RecombinantEquuscaballusAllergenEquc1Equc1兔子327-ORY0030RecombinantOryctolaguscuniculusAllergenOryc3Oryc3鼠328-RAT0030RecombinantRattusnorvegicusAllergenRatn1Ratn1附表2：食入类过敏原甲乙流毒株+重组蛋白免疫动物+小鼠/兔子效价测定+免疫器官分离ELISA经典、快速、批量化胶体金简便、直观、快速时间分辨荧光快速半定量样本应用验证杂交瘤4大抗体制备平台噬菌体展示文库Beacon单B细胞抗体发现抗体筛选全面覆盖靶点：H1N1、H3N3、H5N7适用多种应用：ELISA、WB、中和筛选储备单抗：200+株抗体发现特点：经典流程多种方式注意细节扩大库容抗体筛选特点：技术多样结合实际应用特异性更强灵敏度更高实例3.甲乙流病毒层析抗体的开发义翘神州抗体：40208-R014(标金)-40208-R061（划线）抗原：40205-V08B灵敏度：100pg/mL甲流乙流抗体：40438-R036（标金）-40438-MM10（划线）抗原：40438-V08B灵敏度：50pg/mL义翘神州抗体：10395-MM72（标记）10395-R058（划线）抗原：

10395-HNAE灵敏度：10pg/mL10pg/mL的灵敏度（12.75>4.97）25-500pg/mL范围内，IL-6定量检测试纸条线性良好，相关系数(R)为0.9985。实例4.炎症风暴IL-6抗体的开发-时间分辨荧光义翘神州BNumberofPoints5DegreesoofFreedom3ResidualSumofSquares0.00893Pearson’sr0.99859RValue0.99859Adi.R-Square0.99623T/C值扫描位置免疫类原料开发的难点与挑战04义翘神州04重组抗原形成接近天然抗原的结构抗原活性良好检测结果更加可信抗原结构分析分子构建设计更适合的表达系统选择蛋白纯度是基础减少杂质干扰提升稳定性优化蛋白表达和纯化工艺包涵体的纯化和复性折叠策略其他稳定剂（表面活性剂等）抗原开发的核心问题-与天然蛋白一致纯度得率活性稳定性高品质抗原义翘神州得率尝试多种表达系统（目的蛋白表达的相对含量会有差异）优化不同的培养条件（DO、温度、pH等）细胞破碎方法（超声、高压均质等）活性缓冲液体的离子强度纯化步骤设计（层析填料选择、层析顺序）融合蛋白或亲和标签的影响稳定性减少释放的任何蛋白酶确定稳定性时效跟踪评价蛋白的稳定性义翘神州抗原开发的核心问题-与天然蛋白一致抗体开发中的问题采用多种免疫原进行免疫（蛋白、核酸、细胞等）采用多种抗体制备手段尽可能的制备较大的抗体筛选库由抗体的开发和筛选过程决定，几