药典翻译USP29-621色谱法　中文译稿

USP29-621色谱法30-PAGE30PAGE26PAGE30USP29-621色谱法<621>色谱法本章内容包括在色谱仪中使用的术语和操作法，并且提供了全面的信息。原料药和制剂的色谱操作法的具体要求，包括吸附剂和展开剂，将在个论中给出。色谱法是指溶质在一个由两相或多相组成的系统中按照不同的动态迁移过程使之分离的方法，每种物质在给定的方向不断的迁移，并且不同的物质由于具有不同的吸附、分配、溶解性、蒸汽压、分子大小或离子强度使之呈现出不同的迁移率。这样分离得到的每种物质可以通过分析方法得到鉴定或测定。一般的色谱技术需要溶质在不同的两相中进行分配，其中一相是固定的（固定相），另一相是流动的（流动相）。流动相使溶质在固定相中流过，使之与流出更早或更晚的其它溶质呈现分离状态。一般地，溶质借助于被称为“洗脱液”的液体或气体流从固定相中转移出。固定相可以表现为吸附作用，例如活性氧化铝、硅胶的吸附作用，或可以通过溶解溶质起作用，将之在固定相和流动相之间分配。在后者的过程中，被涂抹在惰性支撑物上的液体，通过化学键合在硅胶上的液体，以及直接在熔融的硅毛细管壁上的液体被作为固定相。在气液色谱、纸色谱和各种形式的柱色谱以及被指定为即液-液分离的薄层色谱中，分配是主要的分离机理。实际上，分离经常是吸收和分配作用相结合的结果。其它的分离原理包括离子交换、离子对形成、分子排阻、疏水效应以及手性识别。在USP操作法中所使用的在定性和定量分析方面有用的色谱方法有柱色谱法、气相色谱法、纸色谱法、薄层色谱法(包括高效薄层色谱)和加压液相色谱法（通常也被称为高压或高效液相色谱法）。纸色谱和薄层色谱法由于其方便性和简单性通常用于鉴定的目的；柱色谱法提供了更宽的固定相选择机会，并且在从混合物中分离单个化合物以及定量方面是很有用的；现代的高效薄层色谱、气相色谱法和加压液相色谱法需要更加精细的装置，通常可以提供高的分离度，并鉴定和定量非常少量的物质。在鉴别试验中标准物质的使用用于鉴别试验的标准物质的使用—在纸色谱和薄层色谱法中，某一给定的化合物在介质中从基线迁移的距离（用吸收最强的斑点的位置进行测量）与流动相前沿的迁移距离的比例，被称为化合物的RF值。给定物质与标准物质迁移的距离的比值为RR值。RF值随试验条件变化很大，因此，鉴别最好在这样的情况下完成：可疑化合物中的可信样本与一标准物质在同一色谱条件下被使用。针对此目的，色谱可以这样准备：在薄层吸附剂或纸上划一直线(此直线平行于色谱板或纸的边缘)，将被鉴定物质的溶液、可信的样本以及几乎等量的待鉴定物质和可信的样本的混合物。每次点样含有大致相同重量待用色谱分离的物质。如果待鉴定物质和可信的样本是相同的，所有的色谱图中具有相同的颜色和RF值，并且混合样色谱图只有一个斑点，即RR为1.0。组份的定位组份的定位—纸色谱或薄层色谱产生的斑点可以通过以下方式定位：（1）如果化合物在自然光或紫外区的短波长（254nm）或长波长（360nm）处可见的话，可以直接观察，（2）用可使斑点可见的试剂处理后（用带有雾化器的试剂最方便使用）在自然光或紫外光下观察，（3）如果有放射性物质存在时可以使用盖革氏计数器或自动放射性技术，或者（4）在已接种的环境中，放置吸附剂和物质的可移动部分，根据促进或抑制细菌生长来观察。在开放的柱色谱、具有恒流的加压液相色谱和气相色谱中，保留时间t，即样品从进样到洗脱峰出现的时间，可以用作鉴定的参数。待检定物质或其衍生物的溶液、参照物质的溶液以及等量的这两种物质的混合物的溶液，在同一色谱条件下通过相同的色谱柱，被连续的色谱分离。混合物中应当只有一个色谱峰出现。测试样品、参照物质及其二者混合物的保留时间与内标物的保留时间的比值被称为相对保留时间RR，通常也被作为鉴定的参数。从参照物质和混合物中测得供试物质的RR、RF或t值的偏差，不应超出含量测定中重复进样参照物质时测定的可靠性评估(统计意义上的)。在给定的条件下使用的这些方法的色谱鉴别主要表明一致性，但不包括最后的鉴别。在3～6组不同色谱条件（温度、柱填料、吸附剂、洗脱剂、展开剂、不同的化学衍生物等）下鉴定参数的一致性可以增大样品与参照物质是相同物质的可能性。然而，许多(同分)异构的化合物可能仍不能被分离。对流出物进行专属的和相关的化学、光学或物理化学鉴定，并结合色谱鉴定，是最有效的鉴定规则。针对此目的，每种从色谱中分离出来的成分可被收集起来以进行更进一步的鉴定。纸色谱纸色谱中的吸附剂是一张具有适当质地和厚度的纸。色谱分离是通过与柱吸收色谱相似的单向液相作用实现的。因为纸中自然的含水量，或纸纤维中液相中的亲水成分的选择性的吸胀作用，可以被看作是固定相，分配机制对分离起到了巨大作用。作为替代的方法，可以使用双相系统。将纸用其中的一相浸泡后制成固定相（对未修饰的纸通常采用极性较强的一相）。再将另一相流动相在纸上缓慢展开。展开可以是向上的，这种方式溶剂可以通过毛细管作用力在纸上展开；也可以是向下的，在此方式下，溶剂的流动与重力有关。有报道称，当色谱沿纸张纹理（机械方向）展开，与纸张纹理沿垂直方向展开时相比，其RF值有所不同，因此，在一系列的色谱中，关于溶剂流经的纸张纹理的定位需保持一致。（机械的方向通常由纸色谱的生产厂商在包装上说明）。下行色谱在下行色谱中，流动相在色谱纸中向下流动。仪器装置—下行色谱的基本装备包括以下内容：一个带有用于添加溶剂或释放内部压力的入口的防潮池。防潮池最好是玻璃、不锈钢或陶瓷的，并且要设计成在不打开池盖时就可以观察到色谱运行情况。带有适当的盖子和密封剂的高玻璃筒是非常方便的。一个比池的内高度短5cm的耐腐蚀材料的架子。架子在此作为溶剂槽的支撑物和抗虹吸杆，此杆反过来还可以一个或多个可以容纳比一次色谱运行所需溶剂体积大得多的玻璃槽。玻璃槽的宽度必须要比色谱滤纸的宽度要长。用架子支撑的重玻璃抗虹吸杆，在玻璃槽的外面运行，平行于玻璃槽，并稍高于玻璃槽上方的边缘。宽度至少2.5cm且不超过玻璃槽长度的特殊色谱滤纸可以剪成与池高等长。在滤纸边缘一定距离处用细铅笔画一条平行于滤纸的直线，当滤纸从抗虹吸杆处悬挂下来，使滤纸的上端保存在槽中而下端自由地悬挂在池中时，直线位于杆下方几厘米处。需要注意避免滤纸因被过多的处理或与脏的表面相接触而受到污染操作步骤—将被分析物用适当的溶剂溶解。用微量吸管移取适量体积所配制的溶液(此溶液通常含有1～20μg化合物)，点到沿铅笔画的直线各点距离至少3cm以上的位置，成6～10mm的点。如果所使用的总体积产生的点直径大于6～10mm将点样后的色谱滤纸用抗虹吸杆悬挂在池中，并使滤纸的上端保存在溶剂槽中。池的底部为规定的溶剂系统。用溶剂蒸汽饱和的池子可以便于池壁与被规定的溶剂系统润湿的滤纸成一条直线。(Saturationofthechamberwithsolventvapourisfacilitatedbyliningtheinsidewallswithpaperthatiswettedwiththeprescribedsolventsystem.)确保滤纸在杆下面的部分是悬挂在池中而没有接触到架子或池壁以及池中的液体是非常重要的。池子需要密封使得池子和滤纸用溶剂蒸汽平衡（饱和）。必要时需要释放过大的压力。对于大的池子，平衡过夜可能是必要的。超过完成色谱展开所需体积的流动相体积通过振摇使之与固定相饱和。在池中达到平衡后，将制得的流动相由入口处导入槽中。将入口关闭，流动相就延着滤纸爬行所预期的距离。当打开池盖并移出色谱时必须注意防止溶剂流到滤纸的外面。迅速标记出溶剂前沿的位置，将滤纸干燥。可直接观察并测量色谱图，或经适当地展开后显示所分离药物斑点的位置。将预先确定含有分离药物的滤纸部分剪下来，用适当溶剂洗脱，溶液可以制成已知的体积，并通过适当的化学方法和仪器技术进行定量分析。用同样的方法将不同量的标准品在相同的滤纸上展开，并制成标准曲线来计算。上行色谱在上行色谱中，滤纸（或纸带）的底端被浸入到流动相中，通过毛细管作用使流动相上升到色谱纸上。仪器装置—完整的上行色谱的装备与下行色谱中所用的相同。操作步骤—采用于色谱滤纸所用的检测材料如下行色谱中所述，滤纸被浸入到展开剂中。展开池的底部装有展开剂系统。如果使用双相系统，两相均需要加入。同时还希望池壁与滤纸成一条直线并用溶剂系统使之饱和。将空的溶剂槽放入池子的底部，再将滤纸悬挂其上使带有样品点的一端挂在空溶剂槽里面。将池子密封，按下行色谱中所描述对池子进行平衡。然后将展开剂（流动相）通过溶剂槽的入口将其加入槽中，所要求的量超过完成一次色谱所需的溶剂。再将池子密封。当溶剂前沿达到一定的高度时，打开池子，将滤纸取出、干燥。斑点的定量分析可以按下行色谱中所述的进行。薄层色谱法在薄层色谱法中，吸附剂是一种相对比较薄、均一干燥的、极细的粉末物质，将之附在玻璃、塑料或金属层或板上，其中玻璃板是最常用的。涂布的板子可以看作是“开放的色谱柱”，分离可以通过吸收、分配或二者相结合的作用来完成的，这取决于固定相的特定类型、制备方法和不同溶剂的使用。带有离子交换膜的薄层色谱可以用于收集极性化合物。假定的鉴别可通过完全相同的RF值斑点或区域的观察来实现，并且在相同的板上分别点有相同量的未知物与参照样品的色谱。斑点或区域的大小或密度的视觉比较可用于进行半定量估算。通过密度计量学(吸光度或荧光测量)进行定量测量是有可能的，或者可以将斑点从板上小心地刮下，再用适宜溶剂洗脱，最后用分光光度计测定。对于二元薄层色谱，色谱分离被反转成垂直方向，在另一个用不同溶剂系统平衡的池子中进行色谱分离。仪器装置—可以接受的薄层色谱仪器和材料包含有以下内容：TLC或HPTLC板。色谱一般用预先涂布的板(在玻璃、铝或聚酯的支撑物上)来实现。可能需要在分离之前清洁这些板。这可以通过在适当的溶剂中的迁移或浸没来实现。板也可以通过展开、浸没或喷雾的操作法来被饱和。在使用时，如果需要，板可通过在烘箱内加热至120℃，加热20min来活化。TLC板的固定相的平均粒度为10-15µm，并且HPTLC板的平均粒度为5µm。含有预吸附剂区域的商业生产的板可以被使用，如果在正文中有规定的话。被点到预吸附剂区域的样品在预吸附-解吸界面被展开成明显的、狭窄的区域。可以替代的，适宜大小的平玻璃板，通常为20cm×20一个手工的、半自动的或全自动的实施装置可被使用，以确保板的正确定位和样品在板上的体积和位置的正确转移。可以替代的，可以使用一模板来指导在一定的间隔内点测试点，标记所需的距离，并有助于在板上进行标识。为正确在板上点溶液，推荐使用微量吸管、微量注射器或经校准的一次性的毛细管。对于上行展开来说，由惰性的、透明的材质制成的色谱池并且具有下述规范：一个平坦的底面或成对的槽，一个密封的适合的盖子，以及一个大小合适的盘。对于卧式展开，色谱池应被提供一盛放流动相的贮液池，并且含有一指引流动相向固定相移动的装置。通过喷雾、浸没或暴露于蒸汽中使用试剂转移至盘上的装置，以及为使分离的斑点或区域可见，便于任何所需加热的装置。一个适于在短波长（254nm）和长波长（360nm）紫外灯下观察的紫外光源。一个适当的用来记录可见色谱结果的装置。操作步骤：以适当小的部分分次在板上点所规定体积的供试液与标准溶液，以得到在距较低边缘的适当位置直径为2-5mm的圆点(在HPTLC上为1-2mm)或10-20×1-2mm(在HPTLC板上5-10mm×0.5-1mm)带状区-在色谱法期间，所点的位置必须在展开剂上方3mm(HPTLC)到5mm(TLC)-并且远离板的边缘。在平行于板较低边缘的线上点溶液，斑点中心之间间距至少是10mm(在HPTLC板上为5mm)或带状区边缘之旁的间距至少为4mm(在HPTLC板上为2mm)，并干燥。上行展开-用滤纸在色谱池的到至少一侧拉一直线。向色谱池内倾入一定量的流动相(其量适于色谱池的大小)，在滤纸被浸润以后，深度适于所用板的尺寸。对于色谱池的饱和来说，拧紧盖子并使系统达到平衡。除非另有说明，色谱分离在饱和的池内进行。将板放在池中，确保板尽可能的垂直，并且斑点或带状区在流动相的上方，并关闭池。在流动相移至所规定的距离时移除板。干燥板，并按规定使色谱可见。对于二维的色谱法，在第一次展开后干燥板，并以与第一次展开垂直的方向进行第二次展开。卧式展开-用注射器或移液管向池内的贮液器中加入一定量的展开剂。将板平行地放在池内，按生产商的说明连接流动相装置，并关闭池。如有规定，在两侧同时展开。当流动相已移动已超过正文中所规定的距离时，移出板。干燥板，并按规定使色谱可见。对于二维的色谱，在第一次展开后干燥板，并以与第一次展开垂直的方向进行第二次展开。检测-首先在短波长紫外灯(254nm)下观察干燥板，然后在长波长紫外灯(360nm)或正文中规定的波长下观察。如果进一步说明，喷雾、浸没或将板暴露于所规定的试剂中，如有要求进行加热，观察，并与标准色谱比较供试品色谱。每次观察后记录板的情况。测量并记录每个斑点或区域距离原点的距离，并标出每个斑点或区域所观察的波长。确定主要斑点或区域的RF值。定量测定-用适当的检测仪器，被TLC分离的物质，以及相应的可见紫外光，在衍生前或衍生后可被在板上直接测定。当移动板或测量装置时，板通过测量入射光的反射系数而被测定。相类似的，荧光可使用一适当的光学系统来被测定。含有放射性核素的物质可用三种方法来进行定量：(1)通过向一适当的计数仪移动板直接定量，反之亦然；(2)将板切成带状物，用一适当的计数仪测定每一个带状物的放射性；(3)刮掉固定相，用一适当的闪烁混合物溶解，并用一液体闪烁计数仪测定放射性。用于对板进行直接定量测定的仪器装置是一个光密度计，由一个沿x轴或y轴移动板或测量装置的机械装置、一个记录仪、一个适当的积分仪或计算机，与物质相对应的可见紫外光、一个具有光源的光度计，一个能产生单色光的光学装置，以及有适当灵敏度的光电管组成。所有这些被用于测量反射系数。在测量荧光的情况下，也要求适当的滤光器以预防用来激发的光到达光电管，从而允许发射的光或规定的部分通过。必须证实计数装置的线性范围。对于定量实验来说，在板上点不少于3个待检物质的标准溶液是必需的，其浓度跨越在供试溶液中所预期的值(例如80%，100%和120%)。如需要，用规定的试剂进行衍生，并在所得到的色谱中记录反射系统或荧光性。使用测量的结果来计算供试溶液中物质的量。色谱板的制备：仪器装置-适当尺寸的平坦的玻璃板，一般为20cm×20cm。一个水平盘或水平表面，在铺吸附剂时架在上面。一个贮存架，在干燥和运输期间用来盛装制备好的薄板。盛放薄板的架应当保存在干燥器中或可被密封保存以保护其从干燥炉中取出后不受环境影响。吸附剂中由为适于色谱分析的质地优良的细小的吸附性材料构成，直径通常为5～40µm。它可以直接铺在玻璃板上，也可以用熟石膏[水合硫酸钙（比例为5～15%）]或淀粉浆或其它粘合剂粘到玻璃板上。熟石膏将不会产生象用淀粉所产生的那样坚硬的表面，但它不受强氧化喷雾剂影响。吸附剂中可以含有荧光性材料以助于吸收紫外光的斑点的观察。一个涂布器，当其在玻璃板移动时，将在玻璃板完整的表面上涂上预期厚度的均匀的一层吸附剂。操作步骤—［注意—此操作中所用的纯水需是蒸馏水］用适当的清洁溶液小心地清洗玻璃板(参见清洁玻璃仪器<1051>)，用大量水冲洗直至从板上流下来的水没有可见的水渍或油渍，然后干燥。在涂布吸附剂前确定玻璃板上完全没有绒毛或灰尘是非常重要的。将玻璃板放在水平盘上，在第一张方板的前部边缘和最后一张方板的后部边缘分别放置一张5×20cm的玻璃板，确保所有的玻璃板在涂布吸附剂过程中不产生滑动。将涂布器放置在与水平盘凸起端相对的板的底端。将吸附剂与水在具塞锥形瓶中通过剧烈振荡30秒钟以1:2混合（或按供应商建议的比例），将浆液转移至涂布器中。用30g吸附剂和60ml水足可以制成五块20×20cm的色谱薄板。在2分钟之内用含有水的熟石膏粘合剂完成吸附剂的制备，因为此后，混合物开始变硬。向水平盘凸起端在板上平稳地拖动涂布器，当其移到板的紧邻水平盘凸边的末端时即可移开。（使用后要立即洗去涂布器上残留的吸附剂。）将色谱薄板静置5分钟，然后将之立在贮存架上，在105℃干燥30分钟。最好是将之在干燥箱中架在一定的角度，以防止玻璃板背面湿气的冷凝。薄板干燥后，柱色谱仪器装置—柱色谱操作所需要的仪器非常简单，只包括柱管本身和在柱管底部的一个堵头，堵头可以使用玻璃绒或棉球包裹而成，并将吸附剂或浆液均匀地压缩在管内。有些时候可以使用多孔玻璃板封住柱管的底部以支撑住管内填料。柱管是圆柱形的，并由玻璃制成，除非在个论中规定其它材料。较小直径的出口管被熔化或以其它的方式连接(借助于防漏的接头)在主管的较低的一端。柱管的尺寸是可变的，除了出口管之外，用于药物分析的柱管尺寸通常是均匀的内径为10～30mm、长度为150～400mm。出口管(deliverytube)通常是3～6mm内径，可以包括一个用于准确控制柱中溶剂的流速的活塞。堵头是固定在柱干上的一个圆柱形活塞，可以由塑料、玻璃、不锈钢或铝制成，除非在个论中规定使用其它材料。柱干的内径要比柱管小得多，比有效柱长不低于5cm长。活塞的直径比柱管的内径小1柱吸附色谱将吸附剂（例如活性氧化铝或硅胶、煅烧的含硅藻土的硅胶或色谱纯的硅藻土）以干法或湿法填充到玻璃或石英色谱管中。将用少量溶剂溶解的药物溶液加到柱顶端使之流经吸附剂。药物成分定量地从溶液中分离出来，在柱子顶端吸附在狭小的横截面带中。使其它溶剂借助于重力或空气压力的作用流经此柱，每种物质以其特定的速度向柱子下端流动，从而导致空间上的分离，这被称为色谱。特定物质移动的速度受多种变量影响，包括吸附剂的吸附能力和粒子大小以及表面积、溶剂的性质和极性、静压头或使用的压力，以及色谱系统的温度。如果分离的化合物是带有颜色的或在紫外光下有荧光，可以将吸附剂根据横切面排出，然后分离适当的区段。所预期的化合物可以用适当的溶剂从区段中萃取出来。如果化合物是无色的，可以将排出的吸附剂喷显色剂显色的方法来定位。色谱分离放射性物质可以使用盖革检测器或类似的感光和记录仪器定位。用尼龙等材质制成的透明塑料管要(对大部分溶剂来说是惰性的，并且可以穿过短波长的紫外光)，可用吸附剂填充，并且用作色谱分离柱。这样的柱子可用锋利的刀切成几片，而不用将填料从管中取出。如果使用了荧光吸附剂，柱子可以使用紫外灯进行标记以制备切片。“流动”的色谱应用更为广泛，是一种将溶剂流经柱子直到被分离的药物出现在流出液即洗脱液中的方法。流出的药物可以通过滴定、分光光度计或比色的方法测定，或者可以将溶剂蒸干，药物以纯物质的形式存在。如果柱子中还有第二种药物，可以继续用第一种溶剂洗脱或者使用更强的溶剂洗涤柱子。分离的效果可以通过对单个部分进行薄层色谱来检查。有时会使用在柱中加入混合物的改良方法。将不经分离辅料的片剂粉末以固体药物的形式直接与吸附剂混合，加到柱子的顶端。药物随着溶剂的流动而流出。柱分配色谱在分配色谱中，被分离的物质在两种不能溶合的液体之间分配，其中一种是固定相，被吸附在固体支持物上，从而对流动的溶剂或流动相表现出一个非常大的表面积。非常巨大的连续的液-液接触允许分离的效率，使得普通的液-液萃取根本就不能达到。固体支持物通常是有极性的，并且被吸附的固定相与流动相相比，极性更强。最常用的固体支持物是色谱硅藻土，它是具有适宜大小的能够使洗脱液正常流动的粒子适当的级别是酸洗的Celite545，可从Johns-ManvilleCorp.,22East40thSt.,NewYorkNY10016处得到。。在反相分配色谱中，被吸附的固定相比流动相的极性低，并且固体吸附剂通过用硅烷基化剂适当的级别是酸洗的Celite545，可从Johns-ManvilleCorp.,22East40thSt.,待色谱分离的样品通过以下两种方法中的一种引入到色谱系统中，(a)用少量流动相溶解的样品溶液加入到柱的顶端，或者(b)用少量固定相溶解的样品溶液与固体支持物混合，将之转移到柱子中，作为吸附剂和固定相混合物床体的一层。如前所说，用流动的溶剂来完成展开与洗脱。流动的溶剂在使用前通常需要用固定相进行饱和。在传统的液-液分配色谱中，一个给定化合物在两种液相中分配的程度通常用它的分配系数表示。对于存在解离情况的化合物，可通过改变两相的pH值、介电常数、离子强度和其它性质来控制分配。一个混合物中组分的选择性洗脱可以通过连续变换流动相以提供一个更有利的分配系数，或者通过在流动相的有机溶剂中加入适当的酸或碱在原位上改变固定相的pH值以提供一个更有利的分配系数。除非在个论中另有说明，利用柱分配色谱法进行含量测定和检查需要按照以下的一般方法进行。固体支持物—使用纯化的硅藻土。对于反相分配色谱来说使用硅烷基化的硅藻土。固定相—使用个论中规定的溶剂或溶液。如果在固定相中使用的是混合溶液，在引入固体支持物前必须混匀。流动相—使用个论中规定的溶剂或溶液。如果固定相是含水的溶液，则必须用水平衡流动相，如果固定相是极性的有机液体，则需用此液体平衡流动相。色谱柱的制备—除非在个论中另有规定，色谱柱管内径约为22mm、柱长为200～300mm，没有多孔玻璃板连接在出口管上，没有活塞，内径约为4mm、柱长为50mm。将玻璃绒棉塞放在柱管的底部，将规定体积的固定相置于100～250ml烧杯中，加入规定量的固体支持物，搅拌得到均匀的、蓬松的混合物。将混合物转移到色谱柱管中，压实，轻轻施压，以获得均一的质量。如果规定的固体支持物大于3g，就先将混合物以分次的形式向色谱柱管转移约2g，分别压实。如果含量测定或检查需要多节的柱子，每节中规定含有不同的固定相，在每一节填加之后要压实，在前一节完成之后直接加入下一节的固定相。如果被分析物的溶液与固定相混为一体，使用1g固体支持物和几滴用于制备供试品溶液的溶剂的混合物，通过洗擦用于制备供试混合物的烧杯将其定量地转移到色谱柱管中。在装完的填料上面塞上玻璃绒棉塞。让流动相以适当的流速流经填好的柱子，如果使用的是反相色谱，流速应该成滴。操作步骤—将流动相转移至柱填料顶端的空间，靠重力作用使之流经柱子。在每次更换流动相的组成前和完成洗脱后需用1ml流动相清洗柱的末端。如果被分析物以流动相溶液的形式带入到柱中，就让其完全进入柱填料中，然后分次少量的加入流动相，在加入大量流动相前可以完全排出。含量测定和检查要求使用多个色谱柱串联，而且分步加入指定的流动相，让每部分完全流经每个色谱柱，用前一次的流动相清洗随后的每个柱的末端。气相色谱气相色谱与其它色谱相区别的特点是由气体流动相和固体或不流动的液体固定相组成。液体固定相用于填充柱和毛细管柱。在填充柱中，液相堆积在惰性的支持物细粉上，例如硅藻土、多孔聚合物或石墨化碳，将之填充在典型的内径为2～4mm、长度为1～3m的柱中。在毛细管柱中不含有填料，液相是沉积在柱子的内表面，并且可以被化学键合在柱的内表面。在气固色谱中，固定相是一个具有活性的吸附剂，例如氧化铝、硅或碳被填充于柱子中。聚芳多孔树脂，有时被用于填充色谱柱，未被用液相涂布。当一个被汽化的化合物由载气带入柱中时，它通过动态的反向分配过程在气相和固定相间被分配。化合物被载气带到柱子下游，由于固定相的吸附和解吸附作用而得到或多或少的延长。化合物洗脱表现为分配系数k/，无因次量也叫做容量因子（见符号术语表中符号的定义）。它等于化合物流经色谱柱的时间（保留时间）与未被保留化合物的洗脱时间的比值。容量因子的值取决于化合物的化学性质、本性、数量和液相的表面积、柱温和气体流速。在特定的试验条件下，每个化合物有一特有的容量因子。用气相色谱分离只有发生在相关化合物具有不同的容量因子的基础上。仪器装置—气相色谱由载气源、进样口、色谱柱、检测器和记录装置构成。进样口、色谱柱和检测器是温控的。典型的载气是氦气、氮气或氢气，这取决于所使用的色谱柱和检测器。载气可以由高压气瓶或高纯气体发生器提供，再通过适当的减压阀和流量计流向进样口和色谱柱。将被分离的化合物，可以是溶液或气体，在进样口被注入到气流中。取决于仪器的结构配置，样品的混合物可以直接注入到色谱柱中或在进入色谱柱前，在进样口处汽化并与载气混合。一旦进入色谱柱中，供试品混合物中的化合物借助于不同的容量因子而被分离，而容量因子反过来取决于蒸汽压和与固定相的相互作用的程度。决定供试品混合物中各成分的分离度、保留时间和柱效的容量因子也有温度依赖性。使用程序升温的柱温箱利用温度依赖性使化合物产生差别很大的蒸汽压而达到有效地分离。当化合物在柱中呈现出分离状态时，它们流经微分型检测器，它可以按照每种化合物的量产生响应。所用的检测器类型取决于待分析化合物的性质，并且在个论中有特别的规定。检测器需要加热以防止流出化合物的冷凝。检测器输出信息被记录成时间的函数，得到一色谱图，它由时间轴上的一系列峰组成。尽管有一些峰可能会重叠，但每个峰表现为在被汽化的供试混合物中的一个化合物。洗脱时间是每个化合物一种特性，以峰面积或峰高测量的仪器响应值是样品量的一个函数。进样器—简单的进样装置范围从简单的注射器到全自动程序进样器。被注入到毛细管柱中而没有过载的样品的量比注入到填充柱的样品量要少，可能比用注射器进样的最小量还要少。因此，毛细管柱经常使用能够将样品分流成两部分的进样器，少量的进入色谱柱，大量的流向废液。这样的进样器在分析痕量或微量成分时也可以使用不分流模式。清洗进样器和阱进样器装有一个喷射装置，此装置可以将挥发性化合物溶液带入到低温阱中。当喷射完成时，采集的化合物通过程序升温度阱的快速加热而被解吸到载气中。顶空进样器装有一个温控样品加热池。被装在密封容器中的固体或液体样品，在加热池中加热一段固定的时间，使样品中的挥发性组分在气相或顶空相与非气相间达到平衡。达到平衡后，进样器自动将在样品容器顶部空气的固定量注入气相色谱仪。色谱柱—毛细管柱，通过由熔融石英制成，典型的内径为0.2～0.53mm，长度为5～60m。有时被化学键合到内表面的液相或固定相，厚度为0.1～1.0μm，但非极性固定相可以达到5μm的厚度。当前使用的液相列表见色谱试剂一节。填充柱，由玻璃或金属制成，长度为1～3m、内径为2～4mm。常用于分析的填充柱是含有5%（w/w）液相填料的多孔聚合物或固体支持物。带有大约20%（w/w）液相填料的高容量色谱柱用于大量的检测样品和测量低分子量的化合物，例如水。所需要的容量影响固体支持物的选择。在低容量低极性液相的色谱柱分析极性化合物时所用支持物必须是惰性的以避免峰拖尾。支持物的反应性可以在用液相涂布前通过进行硅烷基化来减少。酸洗过的、熔融煅烧过的硅藻土经常用于药物分析。支持物有不同目数规格，2～4mm色谱柱常用80～120目和100～120目的目数。支持物和液相列于色谱试剂一节。保留时间和峰效果取决于载气流速，保留时间与柱长成正比，分离度与柱长的平方根成比例。对于填充色谱柱，载气流速在大气压和室温下通常以ml/min表示。它通常在检测器出口处用流量计测量，而柱子正处于操作温度下。流过填充柱的线性流速与给定流量的柱子的直径的平方成反比。在内径为4mm的柱子中以流速为60ml/min与内径为2mm的柱子以流速为15ml/min给出相同的线性流速，因此保留时间是一致的。除非在个论中另有规定，填充柱的流速约为30～60ml/min。对于毛细管柱，线性流速通常代替流速。如果使用火焰离子化检测器，根据柱长和稀甲醇溶液的保留时间来测量流速是很方便的。在高操作温度时，蒸汽压太高致使液相逐渐损失，称之为渗料过程。检测器—火焰离子化检测器在大多数药物分析中使用，使用较少的有热电导、电子俘获、氮-磷和质谱检测器。对于定量分析来说，检测器必须有一个宽的线性动态范围：响应值必须在很宽的浓度范围内与检测器内化合物的量成正比。火焰离子化检测器具有较宽的线性范围，对大多数有机化合物敏感。检测器响应值取决于化合物的结构和浓度以及燃烧的流速、空气、组成和载气。除非在个论中另有规定，火焰离子化检测器使用氦气或氮气作为载气用于填充柱，用氦气或氢气作为毛细管柱的载气。热电导检测器使用放在载气流中的加热金属丝。当被分析物随着载气进入检测器时，气流的热电导（载气和样品成分）相对于仅有载气的热电导的差异可以进行测量。一般说来，热电导检测器的响应值与挥发性化合物的结构无关，一般认为其灵敏度比火焰离子化检测器低。碱金属火焰离子化检测器，常被称为NP或氮-磷检测器，含有一个热离子源，例如碱性金属盐或含有铷或其它金属的玻璃元件，这可以使有机氮和磷化合物的有效电离。这是一种选择性检测器，对碳氢化合物几乎没有响应值。电子俘获检测器含有一个离子发射的放射性源。它对含有卤素和硝基的化合物可以表现出很强的响应值，但对碳氢化合物几乎没有响应值。其灵敏度随着卤素原子的数量和原子量而增加。数据采集装置—现代的数据工作站可以接收从检测器输出的信号，计算峰面积和峰高，并打印色谱图，完成色谱参数和峰数据。色谱数据可以贮存和再处理，按要求更改积分和其它计算变量。数据工作站也可以给色谱设计程序，操作大多数操作变量，创造长时间的无人操作条件。数据也可以由简单的记录仪或积分仪来采集，从而进行手动测量，积分仪和记录仪的能力范围包括从提供峰面积打印输出到提供带有峰面积和峰高计算的图谱和为可能的再处理保存数据。操作步骤—填充柱和毛细管柱在使用前必须平衡至使得基线和其它指标达到稳定。这可以通过在方法所要求的温度之上进行操作或通过向色谱中对化合物或混合物重复进样来完成。柱子和填充材料孤厂商提供所推荐的调试操作的用法说明。在使用热稳定的甲基或苯基取代聚硅氮烷的情况下，一种增加惰性和柱效的特殊次序：在氦气流下维持柱温在250℃1小时以除去氧气和溶剂。停止通入氦气，在340℃下加热4小时，然后减少加热至250℃，并用大多数药物是活性的极性分子。成功的色谱可能要求通过用适当的试剂处理活性基团将药物转变成低极性高挥发性的衍生物。硅烷基化试剂被广泛应用于此目的，而且很容易实现。含量测定需要定量比较一张色谱图与另一张色谱图。误差的一个主要来源是样品进样量的不重现性，特别是用注射器进行的手动进样。加入不干扰测定的内标物可以最大可以地减小可变性的影响，此内标物在供试品溶液和对照品溶液中具有相同的浓度。将一张色谱图上的被分析物的响应值和内标物响应值的比值另一张图的比值进行比较。此处的内标物与被检测物质在化学性质上相似，它在检测器和柱特征上的微量差异也有补偿。有些情况下，在用气相色谱定量测定含量的其它方面之前，内标物也可能在样品制备过程中加入。自动进样器可以很大地提高样品进样的重现性，减小内标物的需求。许多专论中要求在样品分析之前系统适用性试验应该符合规定（见系统适用性试验和色谱图解释）。高压液相色谱法高压液相色谱法（HPLC），有时也称为高效液相色谱法，是基于固体为固定相，液体为流动相的分离技术。分离是通过分配、吸附或者离子交换过程来完成，取决于所用的固定相类型。分析有机物方面HPLC比气相有明显优势。将被分析的混合物溶解在适宜溶剂中，且大多数分离在室温条件下即可进行。因此，大部分样品包括难挥发或者热不稳定性化合物可以被分离，而不需要分解或衍生成易挥发性物质。大部分药物分析是基于分配色谱，并且在30分钟内完成色谱分析。同在气相色谱中一样，化合物洗脱时间可以用容量因子k描述（参见符号术语表），它取决于被分析物的化学性质、流动相的组成和流速以及固定相的组成和表面积。柱长也是分离度的重要的决定性因素。只有具有不同容量因子的混合物才可以被HPLC分开。仪器装置—液相色谱是由流动相贮液瓶、在高压下能够使流动相通过系统的泵、将样品引入流动相的进样器、色谱柱、检测器和数据采集装置（例如计算机、积分仪或记录仪）组成的。短的、口径小的，含有密度较高的固定相填料的色谱柱可以为化合物在流动相和固定相间快速交换提供基础。除接收和报告检测器输出结果之外，计算机被用来控制色谱仪设置和操作，这样为长期无人操作提供必要条件。泵系统—HPLC泵系统定量地将流动相通过高压管路和装置从储液瓶运送到色谱柱。现代的系统包括一个或更多计算机控制的计量泵，可根据编订好的程序按梯度色谱的要求来变化流动相的组成，或混合无梯度的流动相（即流动相有固定的溶剂比值）。然而，在预混和的无梯度流动相中各种成分的比例，与那些用多个泵系统混合的相比，更能准确地控制。常见的情况为运行压力高达5000psi或更高，此时当泵的转送速度可达10ml/min。用于定量分析的泵应由惰性的耐流动相腐蚀的材料组成，且在输送流动相过程中以不变的速率运送流动相，同时可以很小的波动运行很长一段时间。进样器—被测化合物在流动相或其他适当溶液溶解后，通过用注射器或定量环手动，或者用自动进样系统注入流动相。后者是由一个转盘或转送架和一个进样装置组成，转盘或转送架上面可以盛放带有可刺破的膜或塞子的样品瓶，进样装置可以将样品从样品瓶中转移定量环中从而进入色谱系统。有些自动进样器可以设计程序来控制样品体积、进样次数和定量环清洗循环、进样时间间隔和其它操作变量。当柱头压力小于70个大气压（大约1000psi）时可以用注射器通过隔膜手动进样。在高压力情况下，进样阀是必须的。一些阀系统将定量环合并在一起，将定量环内所装的供试品溶液在流动相中转移至色谱柱。在另一些系统中，供试品溶液被注射器注入空腔中，转动阀开关，进入流动相。色谱柱—对于大多数药物的分析，分离是通过将供试品溶液在流动相和固定相之间分配来完成的。由非极性流动相和极性固定相组成的系统称为正相色谱，反之，由极性流动相和非极性固定相组成的系统称为反相色谱。分配色谱常被用于分子量小于1000的碳氢化合物的分析。化合物对固定相的亲合力，以及因此而得到的在柱中的保留时间，可以通过调节流动相的极性高低来控制。流动相的极性可以通过加入第二种和第三种有时甚至是第四种成分而改变。现在典型的反相液相色谱的固定相是由有机相化学键合到硅胶或其他材料上而成。粒径通常为3～10μm，但制备柱的大小可以达到50μm甚至更高。带有薄层有机相包裹的小颗粒可以提供低质量传递阻力，因此可以提供化合物在固定相和流动之间的快速传递。色谱柱的极性取决于键合官能团的极性，它包括从相对无极性的十八烷基硅烷到强极性的硝基。液体，未键合的固定相基本上不得溶于流动相。即使如此，常常需要用固定相来预饱和流动相以防止固定相从色谱柱中被剥离。包裹在支持物上的聚合物固定相具有更好的耐用性。用于分析分离的色谱柱内径通常为2～5mm；大内径的色谱柱用于制备色谱。对色谱柱升温可能会获得更有效的分离，但由于存在固定相降解或流动相挥发的可能性，故很少将其加热到60℃以上。除非在个论中另离子交换色谱是用于分离分子量不超过1500的水溶性的、离子化的化合物的分析。固定相通常是合成的有机树脂，阳离子交换树脂含有负电荷活性位点，用于分离碱性物质，例如胺；而阴离子交换树脂含有正电荷活性位点，用于分离还有负电荷基团的化合物，例如磷酸、磺酸或羧酸。水溶性离子或离子化的化合物吸附到树脂上，亲合能力的不同产生了色谱分离。流动相的pH、温度、离子类型、离子浓度和有机物修饰剂可以影响平衡，可以调节这些变量来获得所需的分离度。在分子排阻色谱中，色谱柱中填充的是多孔固定相。按照化合物分子量的大小进行色谱分离。分子量大的分子不能进入孔内而不保留地排出色谱柱。分子量小的分子进入孔内随分子量降低而保留时间增加。这些色谱柱典型地应用于测量聚合物和大分子的降解（见分子排阻色谱一节）。检测器—许多药典的HPLC方法需要使用分光光度度检测器。这种检测器由在色谱柱的末端安装的一个流通池构成。紫外光穿过流通池进入检测器。当化合物从色谱柱上洗脱时，通过流通池产生吸收，导致测量的能量水平发生变化。固定波长、可变波长和多波长的检测器被广泛应用。固定波长检测器只能在一个单波长下操作，典型的为254nm，由低压力汞灯发射光源。可变波长检测器含有一个连续的光源，例如氘灯或高压氙灯，用一个单色器或干涉滤光片在操作者所选择的波长处产生单色光。装有单色器的可变波长检测器的波长准确性需要按照生产厂商的程序方法进行检查，如果检测的波长偏离校正值超过3nm，就要对仪器进行重新校正。现在的可变波长检测器在分析过程中可以程序地变化波长。多波长检测器可以同时在两个或更多波长下测量吸收情况。在二极管阵列多波长检测器中，连续发射的光透过样品池，然后分解成其组成的波长，用二极管阵列分别检测。这些检测器可以获得在整个紫外-可见范围的吸收数据，因而可以提供给分析人员在多个、选择性波长处的图谱以及各洗脱峰的图谱。二极管阵列检测器与固定波长检测器或可变波长检测器相比，有较低的信噪比，因此不适于分析低浓度的化合物。示差折光检测器测量只有流动相的折光率与含有从色谱柱中流出的被分析物的流动相的折光率之间的差异。示差折光检测器用于检测没有紫外吸收的化合物，但其灵敏度比紫外检测器低。它们对溶剂组成、流速和温度的微小变化非常敏感，因此需要一个参比柱来获得满意的基线。荧光检测器对那些本身具有荧光以及可以通过化合物的转化或与荧光试剂在特定的官能团下配对转变成荧光衍生物的化合物敏感。如果需要衍生化，可以色谱分离前衍生，试剂也可以在进入检测器前将其引入流动相中。电位、伏特或极谱电化学检测器用于定量测定能在工作电极处被氧化或还原的样品。这些检测器有选择性、灵敏可信，但要求流动中不能溶解有氧气和还原性金属离子。必须使用无脉冲型泵，并且要确保流动相的pH、离子强度和温度保持恒定。工作电极容易被伴随产生的具有可变响应值的还原产物污染。还有碳糊电极的电化学检测器可以方便地用于定量测定纳克级的易氧化化合物，特别是酚类和儿茶酚类。新的检测器陆续被开发以克服正在使用的检测器的缺点。数据采集装置—现在的数据工作站可以收集和贮存检测器输出的结果，并且可以输出峰高、峰面积、样品鉴定和方法变量的色谱图。它们(数据采集装置)也可以用于液相色谱编程，控制大多数变量，提供长时间的无人值守操作。数据也可以用简单的手动测量记录仪或单独的积分仪来采集，它们可以完成从输出峰面积到输出带有峰面积和峰高结果计算的色谱图，以及贮存后来操作过程中得到的数据。操作步骤—流动相组成可以很大地影响色谱性能和被分离的混合化合物的分离度。对于准确定量的测定，必须使用高纯度的试剂和“HPLC级”有机溶剂。使用的水要求具有低电导和低紫外吸收的适宜质量。特定类型检测器（例如电化学、质谱）所用的试剂，可能要求制定附加的条件，以避免潜在的干扰。对于容量因子k来说，组成比温度的影响更大。在分配色谱中，决定分离的分配系数可以通过在流动相中加入其它化合物而发生变化。在离子交换色谱中，流动相的pH值和离子强度以及组成都会影响容量因子。使用在色谱运行的过程中连续变化流动相溶剂的组成的技术叫做梯度洗脱或程序溶剂。它有时用于容量因子差别很大的混合化合物的色谱分离。对于溶剂组成变化敏感的检测器，例如示差折光检测器，使用梯度洗脱技术比较困难。检测器必须具有一个很宽的线性动态范围，被检测化合物必须与其它干扰物分离。化合物的线性动态范围是指检测器信号响应值与化合物的量成正比的范围。对于定量检测的最大适应性，此范围应该有大约三个数量级。HPLC系统可以通过使用已知浓度的标准品与峰响应值作图，按外标法或内标法进行校正。如果使用自动进样器，可以用外标法获得可信的定量结果。这种方法可以通过直接比较供试品和标准品溶液峰响应值而直接获得。如果必须使用注射器进样，由于在高压下的不重现性，需用已知量的不具干扰性的化合物做内部校正来获得比较好的定量结果，将内标物加入到供试品溶液和标准品溶液中，将药物峰面积响应值与内标物峰面积响应值的比值进行比较。由于仪器设备、进样和技术的正常变化，需要进行系统适用性试验以确保给定的操作系统是可用的。系统适用性试验的主要特征在下文中阐述。对结果解释，见色谱图解释一节。分子排阻色谱法分子排阻色谱法是一种通过其分子大小来分离溶液中的分子的一种高压液相色谱技术。分子排阻色谱法被分成凝胶渗透色谱法和凝胶过滤色谱法，前者利用的是非极性有机流动相和亲水性填料，后者利用的是水溶液流动相和疏水性填料。将样品引入填有凝胶或多孔粒子填料的色谱柱中，用流动相洗涤。分离是通过在填料的内核中重复进行流动相溶剂和固定相内溶剂的溶质交换来实现，填料内核的大小决定可以发生哪种分离。足够小的分子将通过所有的内核空间，在总渗透体积VT处洗脱。另一方面，比填料内核尺寸大的分子只是在填料之间的间隙迁移，不被保留，在排出体积VO（空隙体积）处洗脱。分离按照分子大小在排出体积和总渗透体积之间发生，有用的分离通常发生在此范围的前三分之二处。仪器装置—色谱的组成详见高压液相色谱法。色谱柱—如果必要，色谱柱可以进行温度控制。色谱柱填有能够在恒定的洗涤流速下分离出适当范围分子大小的分离物质。色谱柱的一端通常配备有适于进样的适当装置，例如流速调节器、带膜的注射器或进样阀，也可以连接适当的泵用以控制洗脱剂的流速。也可以将样品直接上到干胶(drainedbed)的表面，此时样品的密度高于洗脱剂，样品就会排列在洗脱剂的下层。填料可以是软的支持物，例如膨胀凝胶，也可以是刚性的，例如玻璃、硅石，或者是溶剂兼容的交联的有机聚合物。刚性填料通常需要加压系统来给出快速分离。流动相的选择通过样品类型、分离介质和检测方法来确定。检测器—色谱柱的出口通常连接到适当的带有自动记录仪的检测器上，记录仪可以监测样品中被分离的组分的相对浓度。检测器通常基于分光光度计、示差计或发光性质（见高压液相色谱法项下的检测器）。如果必要可以使用自动馏分收集器。操作步骤—在分离之前，需要按照个论中规定或厂家说明书对填料进行处理和装柱。如果必要，需按个论中的方法进行系统适用性验证。柱效可以通过理论板数N来评价（见色谱图解释一节）。在特定色谱柱中的化合物洗脱性质可以通过分配系数KD来描述，它可以按下式计算：(VI–VO)/(VT–VO)此处的VO、VT和VI分别是未保留成分保留体积、流经填料的所有内核的成分保留体积和被测化合物的保留体积。每种保留体积可以通过测量峰最大值处的时间来测定。混合物的相对组成成分测定—按照个论的方法进行分离。连续监测洗脱液的成分，测量相应的峰面积。如果在检测中所有成分都具有与检测物在物理化学属性上相同的响应（例如有相应的吸收性），则可以通过面积归一化法计算出每种成分的相对量。如果所检测的在响应性质上不等价，则需要按照个论的校正方法做校正曲线来计算。分子量测定—分子排阻色谱法可以通过与个论下的规定的标准品作比较方法来测定成分的分子量。以校正标准品的保留时间对其分子量的对数作图，针对特定的分离介质，在排阻限度与总渗透限度之间画一条适宜的直线。根据校正曲线，可以估计出成分的分子量。此校正只针对在特定实验条件下所用的大分子溶质-溶剂系统是有效的。聚合物分子量分布的测定—用于校正的物质和测定聚合物分子量分布的方法在个论中有详细说明。然而，样品对比只有在同一实验条件下获得的结果才是有效的。色谱图解释图1是两种物质1和2分离的典型色谱图，t1和t2分别是其相应的保留时间，h、h/2和Wh/2分别是峰1的峰高、半峰高和半峰宽，W1和W2分别峰1和峰2的基线宽度。气泡峰是气相色谱的特征，相应的在液相色谱中为溶剂峰。Fig.1.Chromatographicseparationoftwosubstances.图1两种物质的色谱分离色谱保留时间是化合物的特征，但这不是唯一的。供试品与标准品的保留时间的一致性可以作为鉴定结构的一部分，但只有这一项不足以建立同一性。一个给定的化合物从一张色谱图到另一张色谱图上的绝对保留时间是不同的。由于在大部分规程中，没有必要鉴定一个未保留的峰，因此，正常情况下根据相对保留时间Rr来进行比较：t2和t1分别是供试品和参照品的保留时间，从进样点开始测量，在相同的实验条件下，用相同的柱子测定。其它的规程可以用相对保留,r来鉴定峰的位置：tM是未保留标记物的保留时间，此值需要在操作过程中测量。理论板数N是柱效的一种测量方法，对于高斯型峰，可以按照下面的公式计算：此处的t是物质的保留时间，W是峰的基线宽度，它是通过将峰的两侧直线外推与基线相交得到的。N值与待被色谱分离的物质，以及操作条件(例如流动相或载气流速和温度)，填料的质量，柱内填料的一致性，以及对于毛细管柱来说，固定相膜的厚度、内径和柱长有关。混合物中的两组分的分离度R可以用下式测定：此处的t2和t1分别是两种组分的保留时间，W2和W1分别是两种组分的峰两侧直线外推与基线相交得到的基线峰宽。使用电子积分仪时，R可以简化成按下式计算：按下式计算理论板数N：此处Wh/2是半峰宽，可通过电子积分仪直接得到。然而，如果发生争论，只有按基线峰宽计算的公式是可以使用的。峰面积和峰高通常与洗脱化合物的量成比例。这此通常可以用电子积分仪测量，但可以用比较经典的方法测定。峰面积是通常使用的，但如果有峰干扰发生的话可能会降低准确性。对于手动测量，使用图表应该比通常要快，或者使用比较仪可以测量半峰宽和基线峰宽，以减小测量中的误差。对于准确定量的工作，待测组成应该与其它干扰成分分离。要避免峰拖尾和峰前沿以及溶剂峰的干扰。原料药的色谱纯度检测有时是基于杂质峰的测定，表示为药品面积的百分比。然而，更可取的是用相似浓度的标准品与杂质峰进行比较。标准品可以是相应一定杂质浓度的药品自身，例如0.5%杂质，或者在有毒或信号杂质情况下，标准品是杂质本身。系统适用性系统适用性试验是气相色谱和液相色谱整体实验的一个部分。它们可以被用来证实色谱系统的检测灵敏性(2006.6.1)、分离度和重现性是否适合于分析的要求。设备、电子元件、分析操作和被分析样品组成的一个完整系统，这个系统同样可以被评价，试验正是基于此进行的。检测的灵敏度是一个被用于保证一个给定的色谱分离操作法适应性的尺度，此色谱分离操作法通过注入与供试溶液相同体积的定量限度溶液，来完成在色谱纯度或相关化合物检查中的杂质检测。除非在个论中另有规定，定量限度溶液可以通过用与溶解供试品所用溶剂相同的溶剂来溶解药物对照品来制备，定量限度溶液相对于原料药供试溶液中药物来说浓度为0.05%，而相对于药物制剂供试溶液中的药物来说是0.1%。在定量限度溶液中得到的信噪比不应小于10。(2006.6.1)。分离度R［注—所有的术语和符号都在符号的术语表中详细说明］是柱效N的一个函数，被明确规定以保证相邻的洗脱化合物被互相分离，以建立系统的一般分离能力，并确保药物与内标物分离。作为系统适用性的一个要求，柱效也被明确规定，特别是色谱图中只有一个目标峰时，然而，与直接测量相比，柱效是一个可信度比较低的方法。柱效是峰形的测量，这对痕量成分的测量很重要。在含量测定中对标准样品或其它标准溶液重复进样可以确定精密度是否符合测定要求。除非在个论中另有规定，如果相对标准偏差SR要求是2.0%或更低，要求对被分析物重复进样五次来计算，如果相对标准偏差要求大于2.0%，要求对被分析物重复进样六次后进行计算。拖尾因子T，峰对称性的尺度，值为1时表示为完全对称的峰，其值增加表示为拖尾（见图2）。在某些情况下可以出现值低于1。当峰的不对称性增加时，积分，以及所产生的精密度变得不可信。Fig.2.Asymmetricalchromatographicpeak.图2不对称的色谱峰这些试验可以通过采集来自重复的标准溶液进样或个论中规定的其它特定溶液来进行。在专论中的明确参数的规范不排除使用其他的适于操作的条件（见凡例中的检查和含量测定项下的操作步骤）。调整操作条件以适于系统适用性要求可能是必要的。除非在专论中另有规定，否则系统适用性试验参数是由被分析物的峰来测定。为了确保最终操作系统的有效性，应进行系统适用性试验测定。需求用来证明适当的系统精密度的标准样品的重复进样可以在样品进样之前或在样品进样期间分散进行。系统适用性必须通过在适当的时间间隔内进样适宜的样品来验证。此样品可以是标准品溶液，也可以是含有一定量已知浓度的被分析物和任何其它对于分析系统控制方面有用的物质，例如辅料或杂质。无论何时在仪器或关键试剂方面发生了重大的变化，在进样之前都要进行系统适用性试验。除非系统适用性试验符合规定，否则分析结果是不能接受的。在系统不符合要求时，样品分析结果是不可接受的。符号术语表为了促进结果解释的一致性，在个论中所用的当前公式中所用的符号和定义列在下面。在个论中采用不同的符号与定义时，正文的内容中有解释。［注－在同一公式中出现的W和必t须用同一单位表示。f从峰的最高点到峰前沿的边缘的距离，此距离在基线以上5%峰高处进行测量k容量因子N色谱柱的理论板数r相对保留：ri在色谱中得到的一杂质的峰响应值rIs在色谱中得到的一内标物的峰响应值rS色谱图中标准品的峰响应值rU色谱图中分析物的峰响应值R两个色谱峰之间的分离度或RF色谱的阻滞因子，等于从初始点到斑点中心与初始点到溶剂前沿的比值Rr相对保留时间Rrel相对阻滞，RS在含有标准品和内标物的标准品溶液中的峰响应比值RU在含有分析物和内标物的含量测定供试品溶液中的峰响应比值SR(%)用百分比表示的相对标准偏差此处的Xi是N次测量中的一个单次测定，X是测量的算数平均值T拖尾因子t所测量的从进样到峰洗脱最大值处的保留时间ta非延迟成分的保留时间，具有热电导检测的空气W将峰两侧直线外推与基线相交得到的基线峰宽Wh/2在半峰高处的峰宽W0.05在5%峰高处的峰宽色谱试剂下面所列的填料（L）、相（G）和支持物（S）是为了便于色谱工作人员参考。［注－所列的粒度大小都是常用的，如果要求有更好的粒度，将在个论中明确规定所需要的粒度大小。在以下所列的填料和载体的目录中可能会有使用更宽范围的色谱柱。当需要明确更特定的色谱条件时，需要在个论中明确指出。］填料L1—十八烷基硅烷化学键合到多孔硅胶或陶质微孔颗粒上，3～10μm直径，或整体的硅棒。L2—十八烷基硅烷化学键合到已经结合到固体球形内核的可控表面孔度的硅胶上，30～50μm直径。L3—多孔硅粒子，5～10μm直径。L4—已经结合到固体球形内核的可控表面孔度的硅胶，30～50μm直径。L5—已经结合到固体球形内核的可控表面孔度的氧化铝，30～50μm直径。L6—将磺酰化的氟碳化合物聚合体包裹在固体球形内核的强阳离子交换填料，30～50μm直径。L7—辛基硅烷化学键合到多孔硅胶，3～10μm直径。L8—单分子层氨基丙基硅烷化学键合到完整的多孔硅胶上，10μm直径。L9—直径为3-10µm的不规则或球形的完整的多孔硅胶，具有化学键合的强酸性阳离子包裹。L10—腈基化学键合到多孔硅胶，3～10μm直径。L11—苯基化学键合到多孔硅胶，5～10μm直径。L12—通过将四级胺化学键合到固体硅球形核心的强阴离子交换填料，30～50μm直径。L13—三甲基硅烷化学键合到多孔硅胶，3～10μm直径。L14—强碱性四级铵化学键合到硅胶的阴离子交换填料，5-10μm直径。L15—己烷化学键合到完整的多孔硅胶，3～10μm直径。L16—二甲基硅烷化学键合到多孔硅胶，5～10μm直径。L17—由磺酰基与苯乙烯-二乙烯苯共聚物交联成的氢型强阳离子交换树脂，7～11μm直径。L18—氨基或氰基化学键合到完整的多孔硅胶，3～10μm直径。L19—由磺酰基与苯乙烯-二乙烯苯共聚物交联成的钙型强阳离子交换树脂，约为9μm直径。L20—二羟基丙烷基团化学键合到完整的多孔硅胶，5～10μm直径。L21—刚性的球形苯乙烯-二乙烯苯共聚物，5～10μm直径。L22—由多孔二乙烯苯和磺酸基成胶的阳离子交换树脂，约10μm直径。L23—由多孔聚甲基丙烯酸树脂或聚丙烯酸树脂和四级铵基团成胶的阴离子交换树脂，约10μm内直径。L24—由乙烯基与多个羟基在表面聚合组成的半刚性亲水胶，32～63μm直径。[可以得到由YMCCo.,Ltd生产的YMC-PackPVA-SIL，并由WaterCorp销售().]L25—能够分离分子量为100-5000（按聚环氧乙烷测定）的化合物的填料，可以用于中性、酸性和碱性的水溶性聚合物。比较合适的是聚甲基丙烯酸树脂和聚羟基化的醚（表面含有一些残留的羧基）交联体。L26—丁基硅烷化学键合到完整的多孔硅胶，3～10μm直径。L27—多孔硅胶，30～50μm直径。L28—多功能支持物，由高纯的、100Å的、被键合了阴离子交换剂的球形硅胶基质构成，除了反相C8功能外，还有氨基的功能。L29—γ-氧化铝、反相、低碳含量、氧化铝基质的聚丁二烯球形粒子，5µm直径、80Å孔体积。L30—乙基硅烷化学键合到完整的多孔硅胶，3～10μm直径。L31—四级胺键合到核心为2000Å孔径的8.5µm大孔橡胶粒子上的有选择性的，强阳离子交换树脂，由乙基乙烯基苯与55%二乙烯苯组成。L32—由L-脯氨酸和铜复合物共价结合到不规格的硅胶而成的手性配位交换填料，5～10μm直径。L33—能够分离分子量范围为4,000-500,000右旋糖苷的填料。它是球形的，硅胶基质的，具有pH稳定性。[备注：可得到的为来自TosohBiosep的TSKgelG4000SWXL,]L34—由磺酰基与苯乙烯-二乙烯苯共聚物交联成的铅型强阳离子交换树脂，约为9μm直径。L35—具有亲水（二醇类型）分子的单层键合相，孔径为150Å的锆稳定的球形硅胶填料。L36—L-苯甘氨酸的3,5-二硝基苯基衍生物共价结合到5μm的氨基丙基硅胶上。L37—能够分离分子量为2,000-40,000的蛋白质的填料，是一种聚甲基丙烯酸树脂。L38—用于水溶性样品的甲基丙烯酸基质的分子排阻填料。L39—亲水的聚羟甲基丙烯酸硅胶的完整的多孔球形树脂。L40—三-3,5-二甲基苯基氨基甲酸纤维素酯包裹的多孔硅胶，5～20μm直径。L41—将α1-酸性糖蛋白固定在球形硅胶上，5μm直径。L42—辛基硅烷和十八烷基硅烷基团化学健合到多孔硅胶上，5μm直径。L43—五氟苯基通过丙基化学健合到多孔硅胶上，5～10μm直径。L44—多功能支持物，由高纯的、60Å的、被键合了阳离子交换剂的球形硅胶基质构成，除了反相C8功能外，还有磺酸基的功能。L45—β-环糊精键合到多孔硅胶，5～10μm直径。L46—聚苯乙烯/二乙烯苯与四级胺功能的橡胶珠凝聚而成，10μm直径。L47—被三甲基氨基化的高容量阴离子交换多微孔层，8μm直径。[备注：可以得到的为CarboPacMAI并由DionexCorp销售,()]L48—磺酰化的交联聚苯乙烯，外层为亚微型的多孔的阴离子微珠，15μm直径。L49—将聚丁二烯薄层包在球形多孔氧化锆颗粒表面的反相填料，3～10μm直径。[可得到的为ZirchromPBD，由ZirChromSeparations,Inc.,生产，并由Alltech销售，www.A]L50—具有反相和强阴离子交换功能的多功能树脂。树脂由乙基乙烯基苯55%交联二乙烯基苯共聚物组成，3～15μm直径，表面积不低于350m2/gL51—三-3,5-二甲基苯基氨基甲酸淀粉酯包裹的多孔球形硅胶，5～10μm直径。[备注：可得到的为来自ChiralTechnologiesInc.,的ChiralpakAD,www.chiraltech.com]L52—由多孔硅胶和磺酰丙基组成的强阳离子交换树脂，5～10μm直径。[备注：可从TosohBiosep得到TSKICSWCation,]L53—由乙基乙烯基苯55%交联二乙烯苯共聚物组成的弱阳离子交换树脂，3～5μm直径。表面为羧基和/或磷酸功能性单体。容量不低于500µEq/柱。[备注：由DionexCorp.销售的CS14,]L54—将右旋糖苷共价结合到高交联度的多孔琼脂糖珠上的分子排阻介质，大约13μm直径。[备注：可从AmershamPharmaciaBiotech得到SuperdexPeptideHR10/30,]L55—由聚丁二烯-马来酸