DB12T 648-2016 黄瓜品种纯度SSR分子标记检测方法

B31DB12黄瓜品种纯度SSR分子标记检测方法MethodsofidentifyingvarietalpurityofcucumberbyusingSSR-basedmarkers天津市市场和质量监督管理委员会发布本标准起草单位：天津市农业质量标准与检测技术研究所、天津市蔬菜研究黄瓜品种纯度SSR分子标记检测方法下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本GB/T3543.2农作物种子检验规程GB/T6682分析实验室用水规格和NY/T2474黄瓜品种鉴定技术规程SSR分子标记法品种纯度指种子在SSR分子标记带型方面典型一致的程度，用具有本品种特异带型的种子粒数占检测样品种子粒数的百分率表示，以反映某品种特征特性的一致性由几个核苷酸（1-6个）为重复单位聚集而成的长达几十个至几百个bp（一般为100-200bp）的串联重复序列，又称微卫星序列或短串联重复序列，其高度多态性主要来源于串联数目的不SSR分布于黄瓜整个基因组，每个位点上重复单位的数目不同造成了品种间的多态性，利用PCR技术将多态的SSR扩增出来，通过电泳检测扩增产物，利用电泳图谱进行黄瓜品种纯乙二胺四乙酸二钠（EDTA-Na2三羟甲基氨基甲烷（Tris盐酸（HCl，36%十二烷基硫酸钠（SDS）；氯化钠（NaCl）；氢氧化钠（NaOH）；硼酸；去离子甲酰胺；溴酚蓝；二甲苯青）；）；按照GB/T3543.2规定方法扦样，从送检样品中随机取10g种子，分别随机取其亲本种子在玻璃培养皿底部垫上一层厚度适宜的棉花，用自来水浸湿后均匀地撒上种子，再于表面取单株幼苗子叶，放入1.5mL离心管中，在液氮中研碎，放入1.5mL离心管中。将DNA提取液预筛选带型清晰，双亲间差异大，互补性好的引物作为纯度检测的SSR按照附录C规定的方法，进行4.5%变性聚丙烯酰胺凝胶制作及电泳特异带型的种子粒数占检测样品种子粒数的百分率表示纯度，计算公式如下：纯度%=具有本品种特异带型的种子粒数×100%检测样品种子粒数4A.1DNA提取液按照引物合成单的说明先配制100μmol/L的储存液，取适量储存液稀释40倍，配制浓度为2.5mmol/L的使用液。A.36×变性上样缓冲液Tris108g，硼酸55g，0.5mol/LEDA.540%丙烯胺胶丙烯酰胺190g，甲叉双丙烯酰胺10A.64.5%丙烯胺胶20μL亲和硅烷，20μL冰醋酸，加无水乙醇至2mL。现用现配。A.82%剥离硅烷0.1g过硫酸铵溶于1mL超纯水中。现用现配。R:GGAGAGAAATTGGAATTCF:GGGTCTAATATTTGGGGR:GTTTCGCACTCACTCTTF:ACTATCATTCTTTATCCCCAR:TGTAAAAGTGATCAGGAGGR:TGCAATTATGGCAAATCR:TCCATGGTACAACAAGAAF:CATTCTAGGTCAATGAATR:GGGATATGCGTTTGCATF:CCTCTAGACTGAAAAAGAGR:ATTATTTGGGCCTTTGGR:CACACTCTTATGGCTTTCGF:TTGGAAAAGTCGCCAAF:AGAGGGCAAATTGGTGAR:TCCATCCTGTATGATTTGAF:GAGCCATCCATCAGAGR:ACCCACAAGCTTCAGAF:AGGTACGAAACAACGGR:TCGCACTCACTCTTTAF:CACACCATTTACGGTTAR:CATTTGGTTCAGAAAGR:TGGTCAATGAGCTTAGCTTR:AATTTGGTCCAACCCAF:GCAGGTCAGCACCTTCR:TACGCCCGATATTCTTF:CTGGTGGGTTTTCTGAF:AAGTTTATATTACAGTTGCAACR:TGCACATGTTTAATGGR:TCAAGCCGATTTCTCTTR:AGAAGAACACCTGGAACAF:ACCAACTTGTGAAAGGR:CACATGATTCACTTCCTTTCAF:TTTGAGCCTTGAGGCAAR:GCAATTCAACGTAATGF:CACATGACACAAACACAATR:GAGTCCCCAAAAGCAAF:ATTTCTTCCCCCACCAAR:ATGAATCCTCCTCCCAF:CCCTGCAGCTCTTCTTTR:TGGTTACAGAAGCAAAAF:AAACGTCGATCGAGAGR:AAAGAACCGCCATGTC将玻璃板洗净，用无水乙醇擦两遍，晾干。在长板上涂1%亲和硅烷，在短板上涂2%玻璃硅烷。操作过程中防止两块玻璃板互相污染。待玻璃板彻底干燥后，将生。灌胶结束后，将梳子齿向外，轻轻的插入胶中，使其聚合1h以上。待胶凝固后，拔出梳子，将电泳槽组装好，80W恒功率下预电泳15min~在20μLPCR产物中加入4