DB46T-芒小果普瘿蚊检疫鉴定规程

Q/LB.□XXXXX-XXXX芒小果普瘿蚊检疫鉴定规程范围本文件确立了植物检疫中芒小果普瘿蚊的检疫鉴定方法。本文件适用于芒小果普瘿蚊的检疫鉴定。规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。SN/T2122-2015《进出境植物及植物产品检疫抽样方法》术语和定义本文件没有需要界定的术语和定义。基本信息中文名：芒小果普瘿蚊学名：ProcontariniafructiculiJiao,Wang,Bu&Kolesi分类地位：隶属双翅目Diptera瘿蚊科Cecidomyiidae普瘿蚊属Procontarinia。芒小果普瘿蚊的生物学特性参见附录A。方法原理本标准以形态特征为主要判定依据。芒小果普瘿蚊（卵或幼虫或蛹或成虫）经过提取总基因组总DNA后，利用线粒体细胞色素氧化酶亚基I基因（COI）片段的DNA提取、扩增和测序，判定瘿蚊标本的种类是否是芒小果普瘿蚊。器材用具和试剂器材用具扩增仪，电泳仪，紫外分光光度计，凝胶成像系统，冰箱，低温冰箱，制冰机，水浴锅，离心机，电子天平，微量加样器，体视显微镜；放大镜、小毛笔、镊子、剪刀、白瓷盘、解剖针、指形管、标签等。试剂本文件所使用试剂参见附录B.1。现场检查对芒果植株或苗木进行现场检查时，重点检查幼果、花序和花蕾是否有成虫产卵，或者幼虫孵化后蛀食幼果形成的为害蛀孔，是否有活虫或死虫，是否有老熟幼虫出果的虫孔。对现场检疫发现的各种虫态用镊子或毛笔收集，以指形管保存，加贴标签。现场检查抽样参照SN/T2122进行。室内检验检测镜检将现场采集的可疑幼虫、蛹和成虫送到实验室，在体视显微镜下进行形态特征的鉴定。PCR法分子检测对廮蚊类昆虫进行PCR检测，检测方法详见附录B.2。芒小果普瘿蚊鉴定特征普瘿蚊属的形态特征头部：具后头峰，下颚须３节～４节。雌雄触角均具12个鞭小节，第１和第２鞭小节融合。雄虫触角鞭小节呈双结状，端结和基结形状大小接近，其上分别具一圈发达的大环状环丝，其颈部相对较长；雌虫触角鞭小节除少数种类呈与雄虫相似的双结状外，大多呈单结状，结部具带状环丝，其颈部相对雄虫较短。胸部：翅透明。R1脉在翅基部１/２靠前处与Ｃ脉汇合；R5脉较直且在翅端处或翅端稍靠前处与Ｃ脉汇合；Cu脉分叉。跗节爪具基齿或不具齿。雄虫生殖节：尾须通常宽大愈合且其端缘中央略微凹陷，少数种类明显分２瓣；肛下板端缘中央略微凹陷，但不明显分瓣；抱器基节通常具中基瓣，少数种类中基瓣不明显；阳茎显著突出，端部锥状或较为平钝，其上着生一定数量且较小的无毛感觉孔。雌虫生殖节：部分种类产卵器具有一定的伸缩性，另一部分种类产卵器不可伸缩；尾须整体愈合或部分分离；肛下板宽圆但不分瓣。芒小果普瘿蚊的形态特征芒小果普瘿蚊为害图及芒小果普瘿蚊雄成虫的特征图参见附录C。卵长椭圆形，半透明，体长0.15mm～0.25 mm。幼虫幼虫共4个龄期。黄色至橘黄色。长1.8mm～2.2mm，宽0.5mm～0.6mm。触角锥形，长约为基部宽的1.6倍～1.8倍。胸叉具2个齿突，齿突基部隆起，2个齿突由一个U形浅凹分开；与胸叉相近的2组侧瘤突有3个为1组和1个为1组，均无毛。末节端部圆钝，具8个瘤突，1对较大的瘤突角锥状，其余3对较小，在中央的1对小瘤突有微毛。较大的瘤突中间部分颜色略深。蛹橘褐色。雄性体长1.0mm，雌性1.4mm～1.5mm。触角基具微角突；头部的毛短而细。前胸气门不明显，长而粗壮，向前部渐窄，端部略弯曲，气管伸达前端。成虫雄虫。体色：头及胸棕褐色，腹部浅褐色。翅长1.1mm～1.2mm，宽0.5mm～0.6mm。头:头顶复眼桥长6～7个小眼直径。下颚须4节，向端部逐节渐长。单眼突微隆起。触角具12节，第1节与第2节融合；梗节亚球形，略微比柄节长；鞭节为双亚节，每个亚节具一圈环毛；第3鞭节中部的无毛区约为基亚节长度的0.6～0.7倍，颈部长约为端亚节长的1.0～1.1倍；基亚节的环毛伸至端亚节中部，端亚节环毛伸达颈部末端。胸部:翅膜质，被稀疏细鳞片，R1脉和C脉在翅前缘的近中部融合；R5脉和C脉交会于翅端部，Rs脉细缩呈R5脉上的一个隆起，Cu脉叉状。各足密被细鳞和稀疏短毛；前跗节齿状；爪间突与前跗节近等长；爪垫几不可见。腹部:第1节至第6节背板矩形，表面散布鳞片，各节后缘具单排长毛，侧缘及中部散布短毛，前缘具成对毛状感器；第7背板似第6背板，稍窄；第8背板似第7背板，但明显窄小；第2节至第7节腹板矩形，具不规则长毛，侧缘及中部短毛较背板密，前缘具一对紧邻的毛状感器；第7腹板稍窄于第6腹板；第8腹板明显较第7腹板短小。末节：生殖基节伸长；生殖基节基突圆钝，强烈骨化，密生毛列；生殖突粗壮，向端部齿突逐渐细缩，基部三分之一密被微毛，其余部分具稀疏短毛；尾突短宽，几近完全愈合，端缘中部微凹入，端缘具长毛；肛下板窄，略与尾突等长，端部微凹入，端部具若干短毛；阳茎细长，明显长于生殖基节，向端部逐渐变细，末端背侧1/3具无毛点状感器，腹侧1/4较稀疏地散布稍大的感器。雌虫。翅长1.2mm～1.8mm，宽0.6mm～0.7mm。头具单眼突，微隆起。触角鞭节柱状，第3节中部略缢缩，颈部约为小节长的1/3；环毛紧贴表面，由2条水平方向和2条垂直方向的环带交联而成。腹部。背板第1节至第7节，腹板第2节至第7节与雄性相近，但毛及鳞片略多；第8节背板及腹板未骨化，后缘稀疏散布一排短毛。产卵器较伸长，伸出时约为腹部其他部分的0.55～0.65倍；第9节腹面密布短毛，背面无毛被；尾突从端部1/5处分开，密被短毛，背部具若干稀疏长毛，端部具若干中等长度的刚毛；肛下板约为尾突长的1/5，腹面观端部宽圆，后缘具一对毛。其他部分与雄性相近。结果判定以成虫的形态特征为主要依据，蛹和幼虫的形态特征作参考，符合9.2描述的可鉴定为芒小果普瘿蚊。分子检测结果判定见附录B.2.4。标本保存芒小果普瘿蚊制作成三角纸片标本长期保存。

（资料性）

芒小果普瘿蚊的生物学特性A．1寄主仅见报道为害芒果A．2地理分布菲律宾吕宋岛，广西百色A．3为害特点该虫主要在土表以蛹越冬。在12月中旬至翌年4月下旬，成虫羽化，在芒果初花至幼果形成初期，成虫在嫩梢、花梗、花蕾和幼果上产卵，幼虫孵化后即蛀食幼果，造成落果。初期受害幼果在下部果皮上的产卵点象炭疽病发生初期症状，在放大镜下，受害幼果可见清晰的为害蛀孔，剖开米粒大小的幼果，可见长2mm左右的浅黄色幼虫，有些幼果有多个蛀孔，多条幼虫。老熟幼虫掉入土中化蛹，蛹羽化成下一代成虫，形成再次为害。在芒果初花期至幼果形成期内，该害虫可发生数代。A．4传播途经芒小果普瘿蚊成虫飞行能力较弱，不具备远距离扩散能力。主要以幼虫随寄主果实、蛹随寄主附着的土壤，以及卵随寄主的花或子房进行远距离传播。

（资料性）

芒小果普瘿蚊的分子检测鉴定试剂TE缓冲液pH8.0，Tris-盐酸，EDTA，氯化钠，蛋白酶K，氯仿/异戊醇(v∶v=24∶1)，无水乙醇，75%乙醇，Taq聚合酶，琼脂糖，DNA提取试剂盒、PCR反应试剂盒。检测方法样本前处理用于分子生物学试验的瘿蚊样本在提取DNA之前均要作前处理，卵、若虫、拟蛹、成虫或部分组织等瘿蚊样本要用无菌水冲洗数遍，晾干；干标本、乙醇或福尔马林浸泡的标本先用缓冲液（TEpH8.0）浸泡处理1h～2h。瘿蚊基因组总核酸提取试剂盒法将瘿蚊样本移入1.5mL离心管或碾钵中,捣碎或加入液氮碾磨,之后实验步骤根据DNA提取试剂盒的操作说明书操作。瘿蚊基因组DNA溶液置于-20℃冷冻保存。提取液法将单头瘿蚊置于滴有20μL提取缓冲液(50mmol/LTris-HCl、1mmol/LEDTA、1%SDS、20mmol/LNaCl,pH8.0)的Parafilm膜上，以0.2mL的PCR管底部作为匀浆器充分研磨，50μL缓冲液清洗匀浆器4次、合并混匀；然后以微量移液器移入1.5mL离心管，加入5μL蛋白酶K(20mg/mL)，充分混匀后于60℃水浴1h(中途混匀1次)；然后沸水浴5min，加入220μL氯仿/异戊醇(v∶v=24∶1)抽提液，轻柔混匀数十次后，冰上放置10min，10000r/min离心10min，取上清液，加入440μL预冷的无水乙醇，轻轻混匀，待出现少量絮状沉淀后于-20℃放置30min，4℃12000r/min离心15min，小心弃去上清液。加入400μL预冷的75%乙醇洗涤，12000r/min离心15min，小心弃去上清液，然后将离心管倒扣于洁净滤纸上，自然干燥20min每管加入30μL超纯水，充分溶解后于-20PCR扩增提取得到的基因组DNA作为模板于PCR仪上进行扩增。PCR体系为：DNA模板1μl，10×ExTaqBuffer（Mg2+Plus）2.5μl，TaKaRaExTaq0.25μl（1.25U），dNTP0.5μl（100nmol·L-1），引物正向:5'-GGATCACCTGATATAGCATTCCC-3'(COIS)和反向:5′-CCCGGTAAAATTAAAATATAAACTTC-3′各0.25μl（250pmol·L-1），加ddH2O补足至25μl。反应条件为：94℃4min，进入循环：94℃30s，50℃45s，72℃45s，共35个循环，最后延伸10min。取10μl～15μl扩增产物进行1.5%琼脂糖电泳。然后凝胶成像系统观察分析结果。结果判定琼脂糖凝胶电泳结果待测样品与阳性对照扩增出一条大小为446bp的PCR产物带，阴性对照无DNA产物带。将产物进行测序后，结果与GenBank系统中芒小果普瘿蚊的序列一致则可判定样本的种类为芒小果普瘿蚊。

（资料性）

芒小果普瘿蚊为害图和蛹壳特征aaba雌虫在子房基部花中产卵，b正常果实（左上角）和有幼虫逃逸孔的受害果实（中间）ccdc剖开果实显示果实中的幼虫及幼虫室