《中级食品检验工 》课件-实训任务7 大肠菌群的测定

实训任务7大肠菌群的测定中级食品检验工目录二

仪器和用具一

测定原理三

培养基及试剂四

操作方法五

注意事项大肠菌群是指一群能发酵乳糖、产酸产气、需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽孢杆菌。该菌主要来源于人畜粪便，故以此作为粪便污染指标来评价食品的卫生质量，具有广泛的卫生学意义。食品中的大肠菌群数是以每100mL（g）检样内大肠菌群的最可能数（简称MPN）表示。据此含义，所有食品卫生标准中所规定的大肠菌群均应以100mL（g）食品内允许含有大肠菌群的实际数值为报告标准。检查大肠菌群数，一方面能表明食品中有无粪便污染，另一方面还可以根据大肠菌群数量的多少，判定食品受污染的程度。一、测定原理二、仪器和用具恒温箱、水浴锅、天平、显微镜、均质器或乳钵、温度计。平皿：直径为90mm。试管、广口瓶或三角瓶、吸量管、载玻片、接种针。玻璃珠：直径约为5mm。酒精灯、试管架。单料乳糖胆盐发酵管。双料乳糖胆盐发酵管。乳糖发酵管。伊红美蓝琼脂（EMB）。生理盐水。革兰氏染色液。三、培养基及试剂1、检样稀释（1）以无菌操作将检样25mL（25g）放于含有225mL灭菌生理盐水的灭菌三角烧瓶内或灭菌乳钵内，经充分振摇或研磨制成1:10的均匀稀释液。（2）用1mL灭菌吸量管吸取1:10稀释液1mL，注入含有9mL灭菌生理盐水或其他稀释液的试管内，振摇试管使其混匀，制成1:100的稀释液。（3）另取1mL灭菌吸量管，按上项操作依次做10倍递增稀释液，每递增稀释一次，换用1支1mL灭菌吸量管。（4）根据焙烤食品及糖果卫生标准的要求或对检样污染情况的估计，选择3个稀释度，每个稀释度进行3次接种。四、操作方法2、发酵实验选择3个稀释度的样品分别接种于乳糖胆盐发酵管内，接种量在1mL以上者，可用双料乳糖胆盐发酵管；接种量为1mL及1mL以下者，可用单料乳糖胆盐发酵管。每个稀释度的样品接种3管，置于36±1℃的恒温箱内，培养24±2h，若所有乳糖胆盐发酵管都不产气，则可报告大肠菌群阴性：若有产气者，则按下列程序进行检验。四、操作方法（1）分离培养将产气的发酵管分别转种在伊红美蓝琼脂平板上，置于36±1℃的恒温箱内，培养18-24h，然后取出，观察菌落形态，并做革兰氏染色、镜检和乳糖复发酵实验。四、操作方法（2）复发酵证实实验在上述平板上、挑取可疑大肠菌群菌落1~2个进行革兰氏染色，同时接种乳糖发酵管，置于36±1℃的恒温箱内培养24±2h，观察产气情况。凡乳糖发酵管产气、革兰氏染色为阴性的无芽孢杆菌，即可报告为大肠菌群阳性。四、操作方法3、报告根据实验确定大肠菌群为阳性的管数，报告每100mL（g）大肠菌群的最可能数。1）程序大肠菌群的国标检验法采用三步法，即乳糖发酵、分离培养和证实实验。第一步乳糖发酵实验是检验样品的发酵结果，不是纯菌的发酵实验，所以初发酵阳性管经过后两步操作有可能成为阴性。大量检验数据证明，食品中大肠菌群检验程序的符合率、初发酵与证实实验相差很大。一般来说，如果平板上有较多典型的大肠菌群菌落，革兰氏染色为阴性杆菌，即可做出判定。如果平板上典型菌落较少或均不够典型，则应多挑菌落做证实实验，以免出现假阴性。只做一步初发酵，对某些食品来说误差较大。这样做，会有相当部分的合格样品被作为不合格样品处理，应予以注意。五、注意事项2）挑取菌落大肠菌群是一群肠道杆菌的总称，大肠菌群菌落的色泽、形态等复杂多样，而且与大肠菌群的检出率密切相关。在实际工作中，为了提高大肠菌群的检出率，应当熟悉其菌落的形态和色泽。在检验方法中我们选用伊红美蓝平板为分离培养基，在该平板上，大肠菌群菌落大多呈紫黑色，有金属光泽或无金属光泽。菌落形态的其他方面（如菌落的大小、光滑与粗糙程度、边缘完整情况、隆起情况、湿润与干燥情况等）虽也应注意，但不如色泽方面更为重要。五、注意事项选取的菌落数与大肠菌群的检出率也有密切的关系。在实际工作中，由于工作量较大，操作人员通常只挑取一个菌落检验，但影响大肠菌群检出率的因素很多，如食品种类、菌落色泽和形态、细菌种类等，只挑取一个菌落，由于概率问题，很难避免假阴性的出现，尤其当菌落不典型时，更是如此。所以，挑取菌落时一定要挑取典型菌落，若无典型菌落则应多挑取几个菌落，以免出现假阴性。五、注意事项2）挑取菌落3）产气量在糖发酵实验中经常可以看到，在发酵套管内存在极微小的气泡（有时比小米粒还小），类似这种情况能否算作产气阳性，这是许多人经常遇到的问题。大肠菌群的产气量多时可以使发酵套管充满气体，少时产生比小米粒还小的气泡。一般来说，产气量与大肠菌群检出率呈正相关，但随样品种类而有不同，有米粒大小气泡的也有阳性检出。五、注意事项另外，对未产气的乳糖发酵管是否均应做阴性处理，根据大量实践工作经验来看，对这种情况应慎重考虑，有时会遇到在初发酵时产酸无气，但复发酵却证实为大肠菌群阳性的情况。有时套管内虽无气体，但在液面及管壁可以看到缓缓上升的小气泡。所以对未产气的发酵管有疑问时，可以用手轻轻敲动或摇动试管，若有气泡沿管壁上浮，即考虑为有气体产生，应做进一步实验观察。这种情况的阳性检出率可达半数以上。五、注意事项4）MPN检索表最可能数（MPN）是对样品中活菌密度的估测。MPN检索表采用3个稀释度九管法，稀释度的选择基于对样品中菌数的估测，较理想的结果应是最低稀释度3管为阳性，而最高稀释度3管为阴性。五、注意事项在查阅MPN检索表时，应注意以下问题。（1）MPN检索表中只提供了3个稀释度，即1mL(g)、0.1mL(g)、0.01mL(g)；若改用10mL(g)、1mL(g)、0.1mL（g）时，则表内数字应相应降低或增加10倍。其余情况可类推。