《生物产品分析与检验技术》课件-木瓜蛋白酶活力测定

木瓜蛋白酶活力测定方法木瓜蛋白酶简介木瓜蛋白酶，来源于木瓜的一种蛋白水解酶。广泛存在于番木瓜的根、茎、叶和果实内，其中在未成熟的乳汁中含量最丰富。木瓜蛋白酶简介木瓜蛋白酶的活性中心含半胱氨酸，属于巯基蛋白酶具有酶活高、热稳定性好、天然、卫生、安全等特点在食品、医药、饲料、日化、皮革及纺织等行业得到广泛应用。在食品生产中，木瓜蛋白酶主要用于啤酒抗寒、肉类软化、饼干松化。木瓜蛋白酶的应用啤酒抗寒

木瓜蛋白酶在食品生产中的应用

木瓜蛋白酶能够水解啤酒中的蛋白质，避免啤酒冷藏后引起的浑浊，通常用于啤酒抗寒。木瓜蛋白酶能够水解肌肉蛋白和胶原蛋白，使肉类软化，通常用于肉类产品的软化，增加其食用品质。肉类嫩化福林-酚法和紫外分光光度法其中紫外分光光度法因其操作简单、重现性好被广泛使用。木瓜蛋白酶活力测定方法木瓜蛋白酶活力测定方法--紫外分光光度法测定原理蛋白酶在一定温度、pH条件下，水解酪蛋白底物产生酪氨酸，一定时间后，加入三氯乙酸终止酶反应，将未水解的底物沉淀出来，过滤去除，滤液中的络氨酸对紫外光有吸收，用分光光度法在275nm波长下测其吸光度，以酪氨酸为标准品，绘制标准曲线，依据滤液吸光度值计算酶活力。测定依据：中国医药保健品进出口商会团体标准T/CCCMHPIE1.18—2016，木瓜蛋白酶活力的测定仪器和设备分析天平，感量0.01mg恒温水浴锅（37±0.2°C）。紫外可见分光光度计超声波清洗仪器移液器1mL、5mL温度计（精度0.1°C）容量瓶，50ml具塞比色管，25ml试剂溶液配制0.1mol/L的盐酸溶液酪氨酸标准溶液（0.5mg/ml）酶稀释液（pH=5.5）1%的三氯乙酸溶液酪蛋白底物溶液（pH=7.0）磷酸氢二钠溶液（0.05mol/L）依据T/CCCMHPIE1.18—2016，木瓜蛋白酶活力测定方法，在测定前完成试剂溶液的配制待测样品溶液配制

减量法称取试样40mg（精确至0.01mg），加入50mL容量瓶中，加少量酶稀释液，超声溶解，再加酶稀释液定容至刻度，摇匀；以酶稀释液为对照，在波长275nm下，测定其吸光度值；根据不同品种酶活力高低，吸取适量试样溶液加入容量瓶中，加酶稀释液稀释至适当浓度，使其测定的吸光度值在0.2～0.6范围内，充分摇匀，供测试用。待测酶样品溶液需要现配现用，并且在60min内使用。先准备好4支25mL的具塞比色管，其中三支作为平行样品测定，1支作空白样品测定。测定前做好标号-“0”、“1”、“2”、“3”酶样品测定步骤先将酪蛋白溶液放入37°C±0.2°C水浴锅预热5min，按下列程序分五步完成操作。试样测定需要做三个平行样，同时做酶空白。酶样品测定测定流程酶样品测定第一步，分别取待测酶样品溶液1.0mL，加入4支25ml的比色管中，放入水浴锅，37°C水浴，保温10min；第二步，在“1、2、3”号样品具塞比色管中加入预热后的酪蛋白标准溶液5.00mL；同时在“0”号酶空白比色管中加入5.00mL三氯乙酸溶液；同时将4支比色管放入水浴锅，37°C水浴，记录酶反应开始时间。酶样品测定第三步，酶精确分解反应10min后，立即向三支样品比色管中加入5.00mL三氯乙酸溶液，使其反应终止，摇匀；同时在“0”号酶空白比色管中加入预热后的酪蛋白溶液5.00mL，将4支比色管再次放入水浴锅，37°C水浴，保持40min酶样品测定第四步40min后，取出比色管，在室温下用干燥的滤纸过滤。收集滤液到50mL的烧杯中；酶样品测定第五步，上机测定吸光度。打开紫外分光光度计预热，调节波长为275nm；取滤液，用蒸馏水作参比，在275nm波长下测定样品溶液吸光度值和酶空白溶液的吸光度值。其酶样品实际吸光度值为样品测定吸光度值减去酶空白吸光度值。标准曲线的绘制表1：酪氨酸标准溶液配制管号酪氨酸标液的浓度（ug/ml）0.5mg/ml酪氨酸标准溶液体积（ml）0.1mol/L的盐酸溶液体积/ml0005011014922024833034745054551001040按下表配制酪氨酸标准曲线系列浓度溶液，通过上机测定吸光度值，完成酪氨酸测定标准曲线的绘制。标准曲线的绘制分别吸取酪氨酸标准溶液（C=0.5mg/ml）1、2、3、5、10mL于50mL容量瓶中，以盐酸溶液定容，配制成浓度分别为10、20、30、50、100μg/mL的酪氨酸标品溶液，于275nm处测定其吸光度，以标品吸光度A为纵坐标，浓度C为横坐标绘制标准曲线。AC结果计算

从标准曲线上读出酶样品吸光度值，按以下公式计算样品吸光度计算公式式中：A——酶样品吸光度A样——酶样品直测吸光度A空白——酶样品空白吸光度结果计算从标准曲线图上读出酶样品吸光度值所对应的酪氨酸溶液的浓度，计算公式

式中：Ci—由标准曲线得吸光度A所对应的酪氨

酸的浓度，µg/mLK—酶溶液稀释倍数m—酶样品称样量，mg11—比色管中溶液总体积，mL