原代细胞培养和细胞实验设计(陈加祥)

原代细胞的培养细胞实验设计陈加祥，Ph.D第一节、原代细胞培养基本概念：来源于胚胎、组织器官及外周血，经特殊分离方法制备而来的原初培养的细胞称之为原代细胞。初代培养物开始第一次传代培养后的细胞，即称之为细胞系（CellLine）。—能够连续传代的细胞叫做连续细胞系—不能连续培养的称为有限细胞系通过选择法或克隆形成法从原代培养物或细胞系中获得具有特殊性质或标志物的培养物称为细胞株（CellStrain）。原代细胞的培养是从供体取得组织细胞在体外进行的首次培养，是建立细胞系的第一步。原代细胞生物学特性未发生很大变化，最接近和反映体内生长特性。原代细胞往往有多种细胞组成，比较混杂。原代细胞生物特性尚不稳定，如需做较为严格的对比性实验研究，还需进行短期传代培养。一、原代细胞的取材

取材的基本要求：（1）注意新鲜和保鲜：取材时应尽量在4-6h内能制作成细胞；（2）严格无菌；（3）用锋利的器械切碎组织，减少对细胞的机械损伤；（4）去除材料上的血液、脂肪、坏死组织及结缔组织；（5）尽量选用易培养的组织进行培养。胚胎组织易于成熟个体组织，分化低易于分化高的组织，肿瘤组织易于正常组织。二、原代细胞的分离和制作1、悬浮细胞的分离方法组织来源：血液、羊水、胸水或腹水。方法：1000r/min的低速离心10min→沉淀用无钙、镁PBS洗两次，培养基洗一次→调整适当细胞浓度→分瓶培养。若选用悬液中某些细胞，加入细胞分层液，经离心后由于各种细胞的比重不同可在分层液中形成不同层。如：淋巴细胞分离。2、实体组织材料的分离方法实体组织细胞间结合紧密，为了使组织中的细胞充分分散，形成细胞悬液，可采用：（1）机械分散法（2）消化分离法（1）机械分散法适用组织：纤维成分少的软组织。如脑组织，部分胚胎组织。方法：采用剪刀剪切、用吸管吹打分散组织细胞。将已充分剪碎分散的组织放在注射器内使细胞通过针头压出。在不锈钢网内用钝物压挤使细胞从网孔中压挤出。特点：分离细胞简便、快速，但对组织机械损伤大，而且细胞分散效果差。（2）消化分离法组织消化法是把组织剪切成小块，应用酶的生化作用和非酶的化学作用进一步使细胞间的桥连结构松动，使团块膨松，由块状变成絮状，再结合机械法（用吸管吹打分散或电磁搅拌）使细胞团块得以较充分的分散，制成细胞悬液。1）酶消化分离法常采用胰蛋白酶和胶原酶（a）胰蛋白酶胰酶是一种胰脏制品，使细胞间质中的蛋白质水解而使细胞分散。影响胰酶消化细胞能力的因素：①组织类型适于消化细胞间质较少的软组织（肝、肾、胚胎组织、上皮组织）。对含结缔组织较丰富的组织单用无效（如乳腺、滑膜、子宫、肿瘤组织），需与胶原酶合用。②酶的活力：新鲜配制，低温保存。③酶的浓度:

为0.1%-0.25%。④温度:

常用的温度为37℃。⑤pH:

选用7.6~8.0之间。⑥无机盐离子：钙和镁可抑制胰酶的消化作用，配制时应采用无钙镁离子的PBS配制。⑦消化时间：

20分钟为宜，冷消化时可使用低浓度消化液4℃过夜。⑧无血清：血清中含有抗胰蛋白酶因子（b）胶原酶（Collagenase）胶原酶是一种从细菌中提取出来的酶，水解结缔组织中胶原蛋白成分，而不损伤其它蛋白质和组织。适用组织：纤维性组织、上皮组织以及癌组织。对细胞间质有较好的消化作用。有钙、镁离子存在仍有活性。消化作用缓和，无需机械振荡。价格较高，大量使用将增加实验成本。采用胶原酶与胰蛋白酶联合消化。最终浓度0.1~0.3mg/mL。胶原酶Ⅰ：用于上皮、肺，脂肪和肾上腺组织细胞的分离。胶原酶Ⅱ：适用于肝脏，骨，甲状腺，心脏和唾液腺组织。胶原酶Ⅳ：包含至少7种蛋白酶成分，能消化多种组织。胶原酶Ⅴ：可用于胰腺小岛组织的分离（2）非酶消化法（EDTA消化法）EDTA又称螯合剂，全名为乙烯二胺四乙酸。常用不含钙、镁离子的PBS配成0.02%的工作液，对上皮组织分散效果好原理：与细胞上的钙、镁离子结合形成螯合物，利用结合后的机械力使细胞变圆而分散细胞或使贴壁细胞从瓶壁上脱离缺点：细胞易裂解或贴壁细胞从瓶壁上脱离时呈片状，有团块。与胰酶混合使用（1:1或2:1），不仅利于细胞脱壁又利于细胞分散，可降低胰酶的用量和毒性作用。消化分离法的操作步骤：（1）剪切：把组织块剪碎。（2）漂洗：无钙镁PBS洗2-3次。（3）消化：加入消化液（胰蛋白酶/胶原酶/EDTA）于37℃中作用适当时间。（4）弃去消化液：倾斜自然沉降或低速离心法。（5）漂洗：将含有血清、钙、镁的培养基沿瓶壁缓缓加入，中止消化反应，漂洗2-3次后，加入完全培养基。（6）机械分散：采用吸管吹打或振荡法，使细胞充分散开后用纱网过滤后分瓶培养。注意事项（1）组织块必须漂洗2-3次以除去组织中的钙、镁离子和血清对胰蛋白酶和EDTA的抑制作用。（2）胰酶浓度不宜过高，作用时间不能太长，以免过量损伤细胞。（3）消化后组织不仅要尽量弃去消化液，而且动作要轻柔。三、原代细胞的培养方法悬浮细胞培养法:如淋巴细胞组织块培养法：如血管平滑肌细胞消化培养法：如血管内皮细胞1.淋巴细胞分离原理（密度梯度离心）淋巴细胞分离液：由60%的聚蔗糖Ficoll

2份和34%的泛影葡胺1份混合制成。1.0201.200特性：分子量大、无化学活性、比重为1.077士0.001

血液中各种细胞的比重不同：淋巴细胞与单核细胞：1.070粒细胞和红细胞：1.092将血液加至分离液上，通过离心，可使一定比重的细胞按相应密度梯度进行分布。2.淋巴细胞分离步骤：1.抽取静脉血2ml，注含有肝素的无菌试管中摇匀，加入2mlHanks溶液稀释。2.吸管吸取稀释血液沿试管壁缓缓加到含有2ml淋巴细胞分离液的试管中（血液:Hanks液:淋巴细胞分离液的比例为1:1:1）。3.水平式离心2000r/min×20min4.用平口吸管小心吸取中层呈白色雾状的细胞层，用Hanks溶液洗涤两次，每次离心1500r/min×10min。5.弃上清，加RPMI-1640培养液1ml混匀，取少许进行细胞计数及活力测定。6.贴壁法区分单核细胞（易贴壁）和淋巴细胞注意事项1.抽血后在2小时内使用。2.注意将稀释后的血轻轻地沿管壁铺在聚蔗糖液面上，避免破坏其界面。3.在收集单核细胞和淋巴细胞时，将吸管轻轻插入该层后，沿管壁轻轻旋转吸取细胞。2、组织块培养法（组织培养）举例：贴块法培养血管平滑肌细胞步骤：铺瓶：大鼠经颈动脉放血后，无菌操作取一段胸主动脉，置于含Hank‘s液的平皿中漂洗3次，将血凝块洗干净后剥除外膜的纤维脂肪层，纵行剪开血管，刮血管内膜2~3遍，将中膜剪成约1mm2大小碎片，均匀铺在瓶底，25mL培养瓶可接种20~30小块。轻轻翻转培养瓶，使瓶底朝上，然后于瓶内加入适量培养基盖好瓶塞，将瓶倾斜放置在37℃温箱内。翻瓶：待其稍干燥后，将培养瓶缓慢翻转平放，静置培养。培养24小时后再补液，培养初期移动和观察时要轻拿轻放，开始几天尽量不去搬动，以利贴壁和生长，培养3~5天时可换液。7-9天开始有细胞从组织块周围爬出14天左右细胞融合成大片3.消化法原代培养HUVEC（1）无菌条件下取正常分娩胎儿的新鲜脐带(20cm)，用PBS冲洗脐带至无血色液体流出。（2）从脐静脉一端注入0.1%的Ⅱ型胶原酶溶液，夹闭脐带两端，置于37℃培养箱消化。15min后，收集消化液，并加入含20％胎牛血清的M199培基10ml终止消化，注入M199培基反复灌洗脐带，收集冲洗液，与消化液一起于1000rpm离心5min。（3）弃上清液，加入全M199培养液（含20%胎牛血清、100ng/mlVEGF）4ml，吹打使细胞重新悬浮，移入培养瓶中，静置培养。（4）24h后换液，以后每隔3天换液一次，约7天左右细胞长满汇合，可以传代。（5）使用前运用标记因子CD31或VIII因子对内皮细胞进行鉴定。四、培养细胞的纯化1、自然纯化2、人工纯化（1）酶消化法（2）机械划除法（3）反复贴壁法（4）克隆法（5）培养及限定方法（6）流式分选1、自然纯化即利用某一种类细胞的增殖优势，而排挤其他细胞生长，靠自然的增殖潜力最后留下生长优势细胞，去除其他细胞。无法人为选择细胞，时间长有些恶性肿瘤细胞可以通过此方法，自然纯化建立细胞系。2、人工纯化（1）酶消化法如上皮细胞和成纤维细胞对胰酶的耐受性不同：消化细胞时，常是成纤维细胞先脱壁，而上皮细胞要消化相当长的时间才脱壁，特别是在原代培养和培养早期这种差别尤为明显，因而采用多次差别消化法将上皮细胞和成纤维细胞分开。（2）机械划除法上皮细胞和成纤维细胞同时出现，混杂生长。每种细胞都以小片或区域性分布的方式生长在瓶壁上。因此可以采用机械的方法去除不需要的细胞。（3）反复贴壁法成纤维细胞与上皮细胞相比，贴壁快，大部分细胞常能在短时间内（约10-30min）完成附着，而上皮细胞大部分在短时间内不能附着或附着不稳定，稍加振荡即浮起，这样可以利用此差别来纯化细胞。（4）培养基限定方法某些细胞在生长过程中必须存在或必须去除某种物质，否则无法生长，可以利用这种技术来纯化细胞：溴脱氧尿苷(bromodeoxyuridine